雒永岐

【摘要】 目的 探討放射前、后人宮頸癌組織增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)的變化。方法 在多聚甲醛固定的活檢癌組織冰凍切片上，進(jìn)行PCNA的免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果 放療前的宮頸癌組織內(nèi)，多數(shù)癌細(xì)胞呈PCNA免疫染色陽性；照射（30-40Gy）后，多數(shù)癌細(xì)胞無PCNA染色，但間質(zhì)細(xì)胞的PCNA免疫染色明顯升高，大量間質(zhì)細(xì)胞則呈中等或強(qiáng)陽性染色。結(jié)論 放射抑制宮頸癌細(xì)胞的PCNA表達(dá)的同時(shí)，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞的PCNA表達(dá)。提示PCNA的表達(dá)狀態(tài)可作為放射治療中評價(jià)宮頸癌細(xì)胞增殖和間質(zhì)組織修復(fù)的分子指標(biāo)之一。

【關(guān)鍵詞】 增殖細(xì)胞核抗原；宮頸癌；放射療法

文章編號(hào)：1004-7484（2014）-06-3102-01

近年來宮頸癌已經(jīng)成為女性患者中較常見的惡性腫瘤疾病，宮頸癌的放射治療方法具有非常好的療效，放療以后的遠(yuǎn)期生存率也比較高?？梢姡瑢m頸癌放射生物學(xué)機(jī)理的研究，對腫瘤的整體放射水平具有十分深遠(yuǎn)的意義。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種高度保守的蛋白分子，具有參與DNA復(fù)制和DNA修復(fù)的功能，PCNA的表達(dá)情況是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)，研究資料表明PCNA在宮頸癌組織中有表達(dá)，但PCNA在宮頸癌放射治療中的意義，有待于進(jìn)一步闡明。因此我們利用免疫組織化學(xué)等方法，對放射治療中宮頸癌組織PCNA的變化及其意義進(jìn)行了探討。

1 資料和方法

1.1 臨床資料與活檢材料 宮頸癌活檢組織標(biāo)本20例，取自臨床病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌患者，病理分級(jí)為Ⅰ-Ⅱ?；颊吣挲g為34-58歲。其中，放療前標(biāo)本9例，放療后標(biāo)本11例。接受放射治療的患者分別接受盆腔照射30-40Gy/15-20次.宮頸癌活檢組織標(biāo)本，入40g·L-1多聚甲醛0.1mol·L-1的磷酸緩沖液（pH7.4），4℃下固定24-48h.然后換入30g·L-1蔗糖溶液內(nèi)，4℃下過夜.冰凍連續(xù)冠狀切片，切片厚10μm，每例取30張切片，按順序分為3套，置于-20℃保存?zhèn)溆?染色前將切片晾干，然后分別作常規(guī)HE染色、PCNA免疫組化染色和對照染色。

1.2 免疫組織化學(xué)染色（ABC法） 切片于10mmol·L-1磷酸緩沖鹽水（PBS，pH7.4）內(nèi)洗10min，再入含0.3ml·L-1過氧化氫溶液內(nèi)處理30min，用以滅活內(nèi)源性過氧化物酶.經(jīng)PBS洗后，入鼠抗PCNA單克隆抗體（濃縮型第一抗體，從博士德公司購買，用含2ml·L-1正常山羊血清和0.1ml·L-1TritonX-100的PBS稀釋，1∶100）內(nèi)，于4℃下孵育48h.然后入biotin標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1∶200，Vector公司）溶液內(nèi)，室溫下放置4h.入ABC復(fù)合物（1∶200，Vector公司產(chǎn)品）溶液，室溫下孵育2h.每次抗體孵育后均用PBS洗，3×10min.最后入DAB/H2O2溶液（0.05g·L-1/0.01g·L-1）反應(yīng)10min.另外，用正常小鼠血清溶液代替特異性第一抗體孵育切片，作為免疫染色對照。

1.3 半定量分析 參照以往文獻(xiàn)中的定量方法，對PCNA免疫染色陽性細(xì)胞的半定量分析，在放療前（n=8）和放療后（n=10）活檢組織10μm切片（10張/例）上，隨機(jī)選取一高倍視野，計(jì)數(shù)單位面積（6.25mm2）PCNA免疫陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) 比較放療前與放療后兩組的PC-NA免疫陽性胞體細(xì)胞數(shù)目（χ±s），進(jìn)行單因素χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌組織的病理學(xué)觀察 在HE常規(guī)染色的切片上，放射前的宮頸組織可見大量的癌細(xì)胞巢狀分布，癌細(xì)胞呈卵圓形或不規(guī)則型，癌細(xì)胞增殖旺盛，可見病理性核分裂像，腫瘤間質(zhì)較少。經(jīng)15-20次（30-40Gy）的照射后，癌組織明顯減少，少數(shù)殘留的癌細(xì)胞呈巢狀分布，其間為豐富增生的間質(zhì)結(jié)締組織，伴有大量的白細(xì)胞浸潤。

2.2 PCNA免疫陽性反應(yīng) 在應(yīng)用特異性第一抗體孵育的切片上，PCNA的免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈深棕色，主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，少量陽性產(chǎn)物彌散分布在細(xì)胞核膜或核周。在用正常血清取代特異性第一抗體進(jìn)行孵育的切片上，未見到PCNA的陽性染色。

2.3 PCNA免疫陽性細(xì)胞的分布 放射前宮頸癌組織呈PCNA免疫陽性染色，多數(shù)癌細(xì)胞呈中等程度的著色，部分免疫染色產(chǎn)物彌散分布在核膜與核周胞質(zhì)內(nèi)（Fig1）。放射后的活檢組織標(biāo)本上，殘留的癌細(xì)胞巢內(nèi)檢測不到明顯的PCNA免疫染色，而大量的間質(zhì)組織細(xì)胞顯示強(qiáng)陽性的染色（Fig2）。

3 討 論

以往的研究表明PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所必需的一種33-36KD的周期蛋白，它是一種DNA聚合酶δ和ε的輔助蛋白，合成于G1和S期，其合成與表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān).PCNA能與幾種其他DNA復(fù)制與修復(fù)因子，如引物識(shí)別復(fù)合體復(fù)制因子C、核酸內(nèi)切酶Fen-1和DNA連接酶I等結(jié)合，參與DNA的復(fù)制與修復(fù)過程.PCNA在腫瘤組織中的表達(dá)有許多報(bào)道，其中包括宮頸癌癌前病變和癌組織中的表達(dá)。這些研究多認(rèn)為PCNA的表達(dá)可以作為癌細(xì)胞增殖狀態(tài)的生物學(xué)標(biāo)志，即PCNA的表達(dá)強(qiáng)，癌細(xì)胞的增殖快，反之，則增殖率低.但對于放射對宮頸癌細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響則缺乏研究。有學(xué)者研究食管癌放射中PCNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PCNA的表達(dá)有變化，并認(rèn)為在評價(jià)放療效果中有意義。我們的研究結(jié)果表明，放射治療直接殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，這可能是宮頸癌放療效果較好的原因之一。提示PCNA的表達(dá)的變化可以作為宮頸癌放射治療效果的分子指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

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