江東波 馬曉鸝* 李朝暉 蔡偉明 官堂明

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 湛江 524001）

HPLC法測定銀杏葉緩釋微丸膠囊中山奈素、異鼠李素、槲皮素的含量

江東波 馬曉鸝* 李朝暉 蔡偉明 官堂明

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 湛江 524001）

目的建立以高效液相色譜法測定銀杏葉緩釋微丸膠囊中山奈素、異鼠李素、槲皮素含量的方法。方法以C18為色譜柱，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55），檢測波長為360 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量是10 μL。結(jié)果槲皮素在0.1505～0.9030 μg（r＝0.9999）濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.86%，RSD=0.4%；山奈素在0.1450～0.8940 μg（r＝0.9998）濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.79%，RSD=0.5%；異鼠李素在0.0995～0.5970 μg（r＝0.9998）濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.80%，RSD=0.3%。結(jié)論本方法簡便、準確、專屬性強，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

銀杏葉緩釋微丸膠囊；山奈素；異鼠李素；槲皮素；高效液相色譜法

銀杏葉為銀杏科植物銀杏樹的干燥葉，從銀杏葉中分離出大量的極性和非極性化合物，主要包括黃酮（雙黃酮6種，黃酮苷元7種，黃酮苷17種，桂皮酰衍生物5種）、萜類（銀杏內(nèi)酯A，B，C，J及白果內(nèi)酯）、烷基酚和烷基酚酸類化合物[1]。性味甘苦澀平，功效為益心斂肺、化濕止瀉、主治胸悶心痛、心悸怔忡、痰喘咳嗽、瀉痢、白帶。銀杏葉提取物在臨床上主要應(yīng)用于治療冠心病、心絞痛、高血壓、高血脂癥及腦出血痙攣等癥，防治中風(fēng)、心肌梗死、老年腦血管病、癡呆、大腦腦外傷后遺癥、大腦紊亂等[2]。目前開發(fā)的銀杏葉制劑有片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、口服液、滴劑、軟膏、氣霧劑、霜劑等多種劑型，也有銀杏葉緩釋片和緩釋膠囊。國內(nèi)生產(chǎn)的銀杏葉制劑多為普通片劑和膠囊等，存在服用次數(shù)多、生物利用度低等問題，因此有必要進一步研制開發(fā)緩釋制劑，滿足預(yù)防和治療心腦血管疾病的用藥需要。本項目制備了銀杏葉緩釋微丸，為更好地控制本品質(zhì)量，本文采用HPLC法同時測定其中山奈素、異鼠李素、槲皮素的含量以便考察總黃酮醇苷的含量，報道如下。

1 儀器與試藥

Waters2695-2996型高效液相色譜儀（美國Waters公司）。山奈素、異鼠李素、槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號：110861-200808、110860-200608、100081-200406）；銀杏葉緩釋微丸膠囊（自制，規(guī)格：含總黃酮醇苷2 mg/g，批號：100501、100502、100503）；甲醇、乙腈（色譜純，美國迪馬公司）；磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱：KromasilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%的磷酸溶液=45∶55；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此條件下，供試品中山奈素、異鼠李素、槲皮素峰能達到基線分離，理論板數(shù)按槲皮素峰計應(yīng)不低于2500，色譜圖見圖1～3。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品適量置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，得到槲皮素、山奈素、異鼠李素混合對照品貯備液，再精密量取20 mL對照品貯備液置200 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度得到槲皮素、山奈素、異鼠李素的濃度分別是30.1、29.8、19.9 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取銀杏葉緩釋微丸膠囊10粒，研細，精密稱取適量（約相當于銀杏葉提取物80 mg），置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.4 空白供試液的制備

取處方比例輔料，按銀杏葉緩釋微丸膠囊制備工藝制得空白膠囊，再按“2.3”項下制備方法制得空白供試品溶液。

2.5 輔料干擾試驗

取上述3種溶液，照“2.1”項下色譜條件，分別注入液相色譜儀，結(jié)果表明供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)保留時間位置上，有三個相同的色譜峰，而空白供試液在此保留時間內(nèi)不出峰，表明此法專屬性強。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定三者色譜峰面積，以三者的進樣量（X）為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：槲皮素：y=-15701.9+493445.2x(r=0.9999)，線性范圍是：0.1505～0.9030 μg；山奈素：y=-8701.7+464524.1x(r=0.9998)，線性范圍是：0.1450～0.8940 μg；異鼠李素：y=-9341.3+405512.8x(r=0.9998)，線性范圍是：0.0995～0.5970 μg。

圖1 標準品高效液相色譜圖（1：異鼠李素；2：山奈素；3：槲皮素）

圖2 銀杏葉微丸膠囊樣品高效液相色譜圖

圖3 空白樣品高效液相色譜圖

表1 槲皮素回收率試驗結(jié)果

表2 山奈素回收率試驗結(jié)果

表3 異鼠李素回收率試驗結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批供試品（批號100501）6份，按“2.3”項下的方法制備6份供試品溶液，并按照“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別是＝1.1%、0.9%、1.0%，表明此法重復(fù)性好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取上述供試品溶液20 μL，分別在0、1、2、4、8 h進樣測定，槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別是＝0.8%、0.9%、0.7%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)測定基本穩(wěn)定。

2.9 進樣精密度試驗

取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下方法測定槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積，結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別是＝0.7%、0.7%、1.0%，表明此法的進樣精密度良好。

2.10 加樣回收試驗

精密稱定銀杏葉緩釋微丸膠囊（批號：100503，含槲皮素0.75 mg/g、山奈素0.69 mg/g、異鼠李素0.32 mg/g）粉末適量（相當于銀杏葉提取物40 mg），分別置20 mL量瓶中。再精密量取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液5 mL分別加至上述20 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件，測定槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積，計算其測得量，結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素的平均回收率分別是99.86%、99.79%、99.80%，RSD分別是＝0.4%、0.5%、0.3%。見表1～3。

2.11 樣品測定

取銀杏葉緩釋微丸膠囊，研細，精密稱取適量（約相當于銀杏葉提取物80 mg），置20 mL棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解并定容至刻度，搖勻，濾過，按“2.1”項下色譜條件測定槲皮素、山奈素、異鼠李素峰面積，計算銀杏葉緩釋微丸膠囊中槲皮素、山奈素、異鼠李素的含量，按公式：總黃酮醇苷含量=（槲皮素的含量+山奈素的含量+異鼠李素的含量）×2.51，計算總黃酮醇苷的含量，3批樣品測定結(jié)果表明銀杏葉緩釋微丸膠囊中總黃酮醇苷的平均含量是標示量的99.5%，RSD是0.7%。

3 討 論

本文參考中國藥典2005年版的銀杏葉的質(zhì)量標準[3]，并且針對本品的制備工藝及其他輔料各種因素及特性，對含量測定部分稍做改動，以保證檢驗方法的準確性。本緩釋微丸膠囊中含有的輔料較為特殊，經(jīng)實驗證明，直接按藥典方法的流動相系統(tǒng)會使色譜峰拖尾，適當調(diào)整流動相比例可獲得較好峰型與分離度。本文建立的銀杏葉緩釋微丸膠囊的含量測定方法，經(jīng)方法學(xué)驗證結(jié)果滿意。此方法簡便準確、專屬性強、精密度好、回收率高，為考察銀杏葉緩釋微丸膠囊的含量以及穩(wěn)定性實驗提供可靠的方法。

[1] 何正顯,信玉瓊.銀杏葉的化學(xué)成分及抗自由基作用探討[J].山西中醫(yī),2003,19(1):46-47.

[2] 洪梅,梁紅,潘偉明.銀杏葉黃酮類化合物生物效應(yīng)研究概況[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2003,2(1):33-35.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典(Ⅰ部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005: 220-221.

Determination of the Content of Haempferol, Isorhamnetin and Quercetin in Folium Ginkgo Pellets Capsules by HPLC

JIANG Dong-bo, MA Xiao-li, LI Chao-hui, CAI Wei-ming, GUAN Tang-ming
(Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

ObjectiveTo establish a method for the determination of haempferol, isorhamnetin and quercetin in folium ginkgo pellets capsulesMethodsHPLC was performed on a C18column using mathanol-0.4%H3PO4(45∶55) as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was at 360 nm. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 10 μL.ResultsThe linear range of quercetin was 0.1505-0.9030 μg (r=0.9999), the average recovery was 99.86% (RSD=0.4%); the linear range of haempferol was 0.1450-0.8940 μg (r=0.9998), the average recovery was 99.79% (RSD=0.5%); the linear range of isorhamnetin was 0.0995-0.5970 μg (r=0.9998), the average recovery was 99.80% (RSD=0.3%).ConclusionsThe method is simple, accurate, and special and can be used for the quality control of folium ginkgo pellets capsules.

Folium ginkgo pellets capsules; Haempferol; Isorhamnetin; Quercetin; HPLC

R9

B

1671-8194（2014）29-0012-02

*通訊作者：E-mail：J-D-BO@163.com