張桂賢，陳 斌，王曉輝，李 楠，劉佩莉，李光遠(yuǎn)，祝君梅

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020)

正交試驗(yàn)優(yōu)選羧甲基殼聚糖-醋甲唑胺納米微球的制備方案*

張桂賢，陳 斌，王曉輝，李 楠，劉佩莉，李光遠(yuǎn)，祝君梅

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020)

目的:制備羧甲基殼聚糖載藥納米微球，醋甲唑胺為模型藥物，測(cè)量藥物的包封率和納米微球形態(tài)。方法:采用乳化交聯(lián)法，在微乳液的基礎(chǔ)上制備載藥納米微球，對(duì)可能影響藥物包封率的處方因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，篩選出最優(yōu)配方。結(jié)果:羧甲基殼聚糖溶液的濃度對(duì)包封率有顯著性影響，三聚磷酸鈉溶液濃度和醋甲唑胺藥量對(duì)包封率未見影響。優(yōu)化方案的載藥納米微球包封率為49.36%，其電鏡下為較規(guī)整的球型納米微球，平均粒徑386.0 nm。結(jié)論:采用乳化交聯(lián)法，可形成較高包封率的羧甲基殼聚糖－醋甲唑胺納米微球。

羧甲基殼聚糖，納米微球，醋甲唑胺，乳化交聯(lián)

以殼聚糖及衍生物為載體材料的納米給藥系統(tǒng)常用于眼科局部給藥的研究［1］。該系統(tǒng)有控制藥物釋放、協(xié)助藥物向組織滲透和滯留等優(yōu)點(diǎn)［2］。羧甲基殼聚糖生物相容性好，水溶解性優(yōu)于殼聚糖，以其為載體的載藥納米微球可與角膜前表面黏附，延長(zhǎng)藥物滯留時(shí)間，便于藥物透過角膜［3］。醋甲唑胺是醋酸酐酶抑制劑，眼科用藥減少房水生成，臨床用于降眼壓治療，也可用于治療黃斑水腫［4］。但醋甲唑胺水溶性較差，口服給藥，有毒副作用［5］。載有醋甲唑胺的納米微球，可通過局部給藥降低家兔眼壓。本研究用乳化交聯(lián)法直接使親水載體羧甲基殼聚糖包裹醋甲唑胺形成納米微球，探討納米微球的制備工藝和載藥能力。

1 材料及儀器

1.1 材料醋甲唑胺原料藥(武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司)，醋甲唑胺對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量測(cè)定用，純度為99.4%，批號(hào)100589－200501)，羧甲基殼聚糖(CMC，浙江澳興生物科技有限公司，分子量30萬，羧化度80%)，三聚磷酸鈉(TPP)，吐溫－80，乙酸乙酯為分析純，甲醇為色譜純，水為純凈水(娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.2 儀器Model J2－21低溫高速離心機(jī)，LC－2010A高效液相色譜儀，KQ－50E超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，AL204電子天平(梅特勒－托利多公司)，透射電子顯微鏡(LEOL LEM－1010)，Zetasize粒徑分析儀(Malvern公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 納米微球制備條件吐溫－80與乙醇混勻制成3份混合乳化劑，二者的體積比(Km)分別為1∶5，1∶2和1∶1;以0.5%鹽酸為溶劑，配制4.2、6.3和8.4 mg/ml的CMC溶液，以0.5%鹽酸為溶劑，配制2.8、3.7、4.7、5.6和6.5 mg/ml TPP溶液。用乳化交聯(lián)法制備空白納米微球，取2 ml乙酸乙酯，加入3 ml混合乳化劑，在常溫下超聲5 min，以30滴/min速度滴入0.5%鹽酸，形成O/W微乳液。繼續(xù)超聲30 min，待微乳逐漸變清，滴入一定濃度CMC溶液，再滴入3 ml一定濃度的TPP溶液，繼續(xù)超聲1 h，記錄不同配方時(shí)體系的相變狀態(tài)，其中肉眼有乳光的體系為納米微球混懸液。不同配方時(shí)體系的相變狀態(tài)見表1和表2。選擇每個(gè)組合中，體系有肉眼乳光時(shí)(+)所用的最高TPP溶液濃度，作為以后正交分析時(shí)所用TPP溶液的濃度，此時(shí)納米微粒的交聯(lián)比較充分。

表1 混合乳化劑的體積比_為1∶2和1∶5時(shí)反應(yīng)體系狀態(tài)

表2 _混合乳化劑的體積比為1∶1反應(yīng)體系狀態(tài)_

2.2 含量測(cè)定條件的考查

2.2.1 色譜條件［6］色譜柱:TIANHE C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－水(20∶80);檢測(cè)波長(zhǎng):290 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣20 μl。

2.2.2 溶液液備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取醋甲唑胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于50 ml量瓶中，用0.5%鹽酸配制成2 μg/ml的溶液，即得儲(chǔ)備液。取適量，用0.5%鹽酸稀釋，配制成濃度為0.4 μg/ml的對(duì)照液。

2.2.2.2 供試品混懸液的制備載藥納米微球的制備:用乳化交聯(lián)法，將一定質(zhì)量的醋甲唑胺原料藥溶于2 ml乙酸乙酯，加入3 ml混合乳化劑，在常溫下超聲5 min，以30滴/min速度滴入0.5%鹽酸，繼續(xù)超聲30 min，待變清時(shí)，滴入CMC溶液，再滴入3 ml TPP溶液，繼續(xù)超聲1 h，即得到載藥納米微球混懸液。

2.3.2.3 空白混懸液的制備依“2.2.2.2”項(xiàng)下方法，去除醋甲唑胺對(duì)照品，制得空白混懸液。

2.2.3 分離條件考查取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液，依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1?？瞻准{米微球出峰時(shí)間為8～13 min，醋甲唑胺出峰時(shí)間為15 min左右，空白溶液中成分與醋甲唑胺能較好地分離且空白溶液無干擾，此時(shí)的濃度高于正交試驗(yàn)時(shí)體系中吐溫－80濃度。因此空白納米微球和吐溫－80對(duì)醋甲唑胺濃度測(cè)定均無較大影響。

圖1 對(duì)照品(A)供試品(B)空白對(duì)照(C)HPLC色譜圖

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考查精密量取“2.2.2.1”項(xiàng)下儲(chǔ)備液適量，分別用0.5%鹽酸稀釋，配制成濃度為0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以醋甲唑胺濃度(Y)對(duì)峰面積積分值(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=50 793 X－220(r2=0．999 9)，表明醋甲唑胺在0.1～0.8 μg/ml之間與峰面積呈良好線性相關(guān)。

2.2.5 精密度試驗(yàn)取0.4 μg/ml濃度醋甲唑胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，RSD為1.34%，表明重復(fù)性較好。

2.2.6 回收率試驗(yàn)取空白納米微球混懸液配置醋甲唑胺低中高濃度(0.2、0.4和0.6 μg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行3份，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，得平均回收率為97.8%，RSD為1.99%，表明方法準(zhǔn)確度較好，見表3。

表3 回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.3 正交試驗(yàn)選定CMC溶液濃度(A)、混合乳化劑中吐溫－80與乙醇的體積比例(B)，醋甲唑胺質(zhì)量(C)和空白因素(D)，TPP溶液濃度為該組合下體系為納米微球懸液時(shí)的最高濃度。每個(gè)因素有3個(gè)水平，按照L9(34)正交設(shè)計(jì)(見表4)，以包封率、納米微球粒徑和多分散系數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選出最佳工藝條件。驗(yàn)證試驗(yàn)按候選的工藝條件重復(fù)4次，測(cè)定包封率。納米微球混懸液在4℃下16 000 r/min離心，取上清液，定容至25 ml，稀釋500～1 500倍，按照正交試驗(yàn)表分別取適量溶液進(jìn)樣，計(jì)算上清液中醋甲唑胺的濃度及醋甲唑胺的包封率。包封率=(醋甲唑胺總質(zhì)量－上清液中醋甲唑胺質(zhì)量)/醋甲唑胺總質(zhì)量×100%。用粒徑分析儀測(cè)量各組納米微球的粒徑范圍。結(jié)果見表5－8。

表4 因素水平表

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 以納米微球徑為指標(biāo)的方差分析

表7 以包封率為指標(biāo)的方差分析

表8 以多分散系數(shù)為指標(biāo)的方差分析

方差分析表明，以納米微球徑為指標(biāo)，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序?yàn)锳＞B＞C，因素A對(duì)包封率有顯著性影響，而因素B和C不具有顯著性影響。以包封率為指標(biāo)，各因素作用順序?yàn)锳＞C＞B，因素A對(duì)包封率有顯著性影響，而因素B和C不具有顯著性影響。以多分散系數(shù)為指標(biāo)，各因素作用順序?yàn)锽＞A＞C，只有因素B對(duì)包封率有顯著性影響。選擇A3為最優(yōu)項(xiàng)，可以獲得粒徑較小，且包封率較高的納米微球，選擇含吐溫－80量最小的B1為最優(yōu)項(xiàng)，此時(shí)多分散系數(shù)更小，納米微球更均勻，還可以減少吐溫－80用量，減少潛在不良反應(yīng)。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得A3B1C1、A3B1C2、A3B1C3的平均包封率分別為46.43%、49.36%和48.36%(n=4)，選取A3B1C2為最優(yōu)組合。

2.4 納米微球形態(tài)學(xué)觀察將最佳工藝條件制備的CMC－醋甲唑胺納米微球混懸液用醋酸鈾負(fù)染后，在透射電鏡下(270×10 K)觀測(cè)納米微球的形態(tài)為較規(guī)整的球型，粒徑在400～600 nm。照片見圖2。粒徑分析儀測(cè)量載藥納米微球的平均粒徑386.0nm，多分散系數(shù)0.332。

圖2 納米微球的電鏡形態(tài)

3 討論

乳化交聯(lián)法可以用親水性殼聚糖類載體包載親脂性藥物，如高禮［7］等將普羅布考溶于二氯甲烷中，得到O/W乳劑，在經(jīng)過殼聚糖與TPP交聯(lián)得到殼聚糖－普羅布考納米微球。乳化交聯(lián)法要求油相易于揮發(fā)，且在水中有一定的溶解性，使載體材料易于在水油界面上交聯(lián)。乙酸乙酯溶解醋甲唑胺較好，且能滿足上述要求，選為本實(shí)驗(yàn)的油相。實(shí)驗(yàn)的O/W乳劑按照汪楊［8］等人的自微乳化方法配置。

本實(shí)驗(yàn)中使用4.2 mg/ml CMC制備納米微球懸液時(shí)，CMC/TPP最高為2.5～3∶1，低于使用6.3和8.4 mg/ml CMC時(shí)的CMC/TPP比例，而藥物包封率也高于后者?？赡艿脑蚴鞘馆^高濃度的CMC在TPP濃度較低，納米微球交聯(lián)尚不完全時(shí)就已經(jīng)趨于形成沉淀。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過乳化交聯(lián)法可以制備羧甲基殼聚糖為載體，攜帶醋甲唑胺的納米微球。納米微球的安全性和局部給藥效果需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

1Motwani S K，Chopra S，Talegaonkar S，et al.Chitosan－sodium alginate nanoparticles as submicroscopic reservoirs for ocular delivery:Formulation，optimization and in virto characterization［J］.Eur J Pharm Biopharm，2008，68(3):513－525

2Amrite A C，Edelhauser H F，Singh E R，et al.Effect of circulation on the disposition and ocular tissue distribution of 20nm nanoparticles after periocular administration［J］.MoL Vis，2008，14(29):150－160

3Di Colo G，Zambito Y，Burgalassi S，et al.Effect of chitosan and of N－carboxymethyl chitosan on intraocular penetration of topically applied ofloxacin［J］.Int J Oharm，2004，273:37－44

4孫一洲，柳力敏，鐘一凡，等.醋甲唑胺與吸收劑對(duì)視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞激光光凝術(shù)后黃斑水腫的療效［J］.實(shí)用藥學(xué)與臨床，2011，14(6):476－477

5楊飏，高殿文.醋甲唑胺治療青光眼的臨床研究［J］.遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2005，19(3):156

6陸曉梅，王淼，趙人琤.高效液相法測(cè)定兔眼房水中醋甲唑胺的含量.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，27(05):457－459

7高禮，萬錒俊.普羅布考?xì)ぞ厶羌{米微球子的制備及體外釋放［J］.中國(guó)新藥雜志，2009，18(19):1892－1896

8汪楊，吳偉，闕俐.油－吐溫－醇－水體系偽三元相圖在自微乳化制劑研究中的應(yīng)用［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005(6):345－348

Otimization on preparation technology of carboxymethyl chitosan-methazolamide nanoparticles by orthogonal design

Zhang Guixian，Chen Bin，Wang Xiaohui，Li Nan，Liu PeiLi，Li Guangyuan，Zhu Junmei
(Tianjin Institute of Medical and Pharmacoutical Sciences，Tianjin 300020)

Objective:To prepare carboxymethyl chitosan(CMC)drug－loaded nanoparticles，with methazolamide as model drug.The drug encapsulation efficiency and morphology should be measured.Methods:Drug－loaded nanoparticles were preparated in microemulsion by emulsion crosslinking method.The design of formulation factors that may affect the drug entrapment efficiency was optimized to select optimal formulation.Results:The concentration of carboxymethyl chitosan solution has a significant effect on the entrapment efficiency，when sodium tripolyphosphate(TPP)solution concentration and weight of methazolamide don’t effect on the entrapment efficiency.Entrapment efficiency of optimization of drug－Loaded nanoparticles was 49.36%.The nanoparticles is regular and baLL－type，with average particLe size in 386.0 nm on electron microscope.Conclusion:Nanoparticles can be formated with hydrophilic carboxymethyl－chitosan coating lipophilic methazolamide by emulsion crosslinking method，and high encapsulation efficiency can be achieved.

carboxymethyl－chitosan，nanoparticles，methazolamide，emulsion crosslinking

TQ460.6

A

1006－5687(2014)02－0010－04

2013－01－29

天津市衛(wèi)生局科技基金(青年)項(xiàng)目(No.2012KY34)