張朝穎，費(fèi)洪新，張英博，賈博宇，韓玉生，杜 徽，白 云，樸成玉，周忠光

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)院，哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是目前許多國家常見的老年性疾病，主要的機(jī)制是腦組織部位出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)的沉積，淀粉樣物質(zhì)的主要成分是β－淀粉樣蛋白（Amyloid beda，Aβ）［1］。Aβ 的沉積會(huì)引起機(jī)體氧化反應(yīng)，腦組織形態(tài)學(xué)的改變，主要引起的是與機(jī)體學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的部位，例如海馬部位、顳葉皮質(zhì)區(qū)域的改變［2，3］。蝙蝠葛堿（Dauricine，DAU）具有廣泛的生物學(xué)作用，如抗氧化作用［4］、腦缺血保護(hù)作用［5，6］等?；诖吮驹囼?yàn)采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型，研究DAU對(duì)AD小鼠腦組織的保護(hù)作用。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

3月齡雄性、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（B6.Cg－Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax）、體重23 ±2g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)解剖教研室吳樹亮教授贈(zèng)送，并進(jìn)行基因鑒定。動(dòng)物常溫、常濕飼養(yǎng)，自由攝取食物。另外做對(duì)照的小鼠是同月齡、同背景小鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心李寶龍副教授購買提供。

1.2 主要藥物

吡拉西坦購于湖南迪諾制藥有限公司，批號(hào)130325;DAU購于 MUST公司，批號(hào) MUST—13010313，純度為98.66%;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察

該品種小鼠一般狀態(tài)觀察包括進(jìn)食、飲水、體重、毛發(fā)、色澤、活動(dòng)度、光澤度、糞便顏色、墊料潮濕度等指標(biāo)。

2.2 動(dòng)物分組

選擇AD小鼠18只，分3組，其中模型組6只、治療組6只、DAU組6只，另設(shè)立同月齡、同背景的C57小鼠對(duì)照組6只。

2.3 動(dòng)物給藥

每天上午選擇對(duì)照組小鼠6只給予生理鹽水灌胃。模型組6只給予生理鹽水灌胃。治療組6只給予吡拉西坦（0.62 g·kg－1·d－1）灌胃。DAU 組 6 只給予 DAU（20 mg·kg－1·d－1）灌胃，持續(xù)2W。

2.4 多聚甲醛固定

小鼠乙醚麻醉、剪開腹腔、胸腔、右心耳，針頭插入左心室，緩慢勻速對(duì)小鼠灌注生理鹽水，肝變白后緩慢勻速灌注4%多聚甲醛50 mL，斷頭取腦組織固定。

2.5 制備石蠟切片

小鼠灌注固定后流水沖洗、脫水、透明、包埋、－20℃冰箱冷凍組織、切片5μm、做成石蠟切片。

2.6 動(dòng)物腦組織HE染色

石蠟切片脫蠟、脫水、水洗、蘇木精染10 min、沖洗、鹽酸乙醇分化數(shù)秒、水洗、氨水處理、水洗、伊紅染色、水洗、脫水、透明、干燥、樹膠封片、顯微鏡觀察腦組織顳葉皮質(zhì)和海馬的結(jié)構(gòu)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察

對(duì)照組小鼠活動(dòng)自如，逃避反應(yīng)靈敏，皮膚光滑，無瘀斑，毛色光亮，飲食飲水正常。模型組小鼠活動(dòng)能力下降，怕冷，受到刺激躲避反應(yīng)較差，不活躍，皮膚松弛。治療組小鼠，皮膚較光滑，活躍，較模型組改善明顯。DAU組小鼠狀態(tài)比較活躍，飲食飲水正常，反應(yīng)較靈敏。

3.2 動(dòng)物腦組織HE染色

3.2.1 顳葉皮質(zhì)區(qū)域HE染色

腦組織對(duì)照組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞質(zhì)豐富（見圖1A）。模型組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元較小，細(xì)胞核較小，細(xì)胞質(zhì)不豐富（見圖1B）。治療組神經(jīng)元比較正常，排列較規(guī)則（見圖1C）。DAU組神經(jīng)元變性的數(shù)目較少，神經(jīng)元基本正常（見圖1D）。

圖1 小鼠腦組織顳葉皮質(zhì)HE染色（高倍鏡10×40）Fig.1 M ouse cerebral tem poral lobe cortex HE staining（High magnification 10×40）

3.2.2 海馬區(qū)域HE染色

腦組織對(duì)照組錐體細(xì)胞層數(shù)較多，神經(jīng)元錐體形，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)清晰可見（見圖2A）。模型組錐體細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞變性明顯，可見到細(xì)胞核固縮（見圖2B）。治療組和DAU組細(xì)胞形態(tài)和排列方式均得到明顯的改善（見圖2C、2D）。

圖2 小鼠腦組織海馬HE染色（高倍鏡10×40）Fig.2 M ouse hippocampal brain tissue HE staining（High magnification 10×40）

4 討論

生物體衰老的過程是極其復(fù)雜的變化過程，其中自由基的反應(yīng)在其中起到很重要的作用，自由基的大量產(chǎn)生使機(jī)體產(chǎn)生氧化的物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)引起腦組織的損傷，腦組織損傷后神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生改變［2］。DAU具有抗氧化的作用，因此本試驗(yàn)主要研究DAU對(duì)腦組織因抗氧化引起的的形態(tài)學(xué)變化，觀察腦組織顳葉皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

針對(duì)AD模型很多，包括 D－半乳糖加亞硝酸鈉［7］、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因［8］等模型對(duì)機(jī)體的癡呆進(jìn)行研究。本試驗(yàn)采用APP、PS1兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)入C57小鼠的癡呆模型進(jìn)行研究，觀察DAU對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因的形態(tài)學(xué)影響。試驗(yàn)中觀察了各組小鼠的生長狀態(tài)，顯示該品種小鼠對(duì)飼養(yǎng)條件要求很高，需要清潔的飲用水，飼料和墊料專門購買，即使如此，該小鼠生長也非常緩慢。

試驗(yàn)中對(duì)小鼠進(jìn)行了心臟灌注、石蠟切片、常規(guī)的HE染色，染色結(jié)果顯示小鼠腦組織的結(jié)構(gòu)變化。顳葉皮質(zhì)區(qū)域經(jīng)過HE染色顯示腦組織對(duì)照組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞質(zhì)豐富。模型組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元較小，細(xì)胞核較小，細(xì)胞質(zhì)不豐富。治療組神經(jīng)元比較正常，排列較規(guī)則。DAU組神經(jīng)元變性的數(shù)目較少，神經(jīng)元基本正常。

試驗(yàn)對(duì)海馬區(qū)域HE染色顯示腦海馬組織對(duì)照組錐體細(xì)胞層數(shù)較多，神經(jīng)元錐體形，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)清晰可見。模型組錐體細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞變性明顯，可見到細(xì)胞核固縮。治療組和DAU組細(xì)胞形態(tài)和排列方式均得到明顯的改善。綜上所述，DAU可以維持AD小鼠腦組織神經(jīng)元正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，減輕AD的臨床癥狀，從而保護(hù)AD小鼠的腦組織結(jié)構(gòu)。

［1］WU Y L，XIN X J，XIN X L，et al.Research progress about the regulation of GXXXG structures in the Alzheimer-related protein［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（1）:1—4.

［2］ROSSIL，MAZZITELLIS，ARCIELLOM，etal.Benefits from dietary polyphenols for brain aging and Alzheimer’s disease［J］.Neurochem Res，2008，33（12）:2390—2400.

［3］PEREIRA AG，PORTUGUEZ MW，DACOSTA DI，et al.Route learning performance:is ita hippocampus function?［J］.Cognitive and Behavionral Neurology，2011，24（1）:4—10.

［4］何麗婭，李立中，吳基良.蝙蝠葛堿的抗氧化實(shí)驗(yàn)研究［J］.中草藥，1997，28（8）:479—481.

［5］李艷紅，黃向江，盧浩浩.蝙蝠葛堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血及線粒體氧化損傷的保護(hù)作用［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，34（3）:270—273.

［6］李艷紅，龔培力.蝙蝠葛堿對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠腦缺血的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2004，20（5）:564—567.

［7］何勝，玉瑩，陳菊芳，等.D－半乳糖加亞硝酸鈉建立癡呆癥小鼠模型和中藥治療的效果［J］.中國老年學(xué)雜志，2014，34（2）:422—424.

［8］周妍妍，劉艷麗，董春雪，等.五味子醇甲對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠腦組織突觸素、α－突觸核蛋白表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（8）:1076—1079.