石巖，劉謙，張永清，李佳

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

*中藥與天然活性產(chǎn)物專欄*

5個(gè)產(chǎn)地羊角藥材中氨基酸比較研究

石巖，劉謙，張永清，李佳*

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

本文采用高效液相柱前衍生異硫氰酸苯酯法（PITC-HPLC）檢測(cè)了5個(gè)產(chǎn)地羊角藥材的氨基酸種類及含量，為完善羊角藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。結(jié)果表明，5個(gè)產(chǎn)地羊角藥材氨基酸HPLC與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的出峰順序一致，出峰時(shí)間接近，PITC-HPLC可用于氨基酸的檢測(cè)。四川山羊角藥材樣品中氨基酸總量為94.3%，且多種氨基酸含量較高，遠(yuǎn)超過其他4個(gè)產(chǎn)地樣品氨基酸總量。山東菏澤產(chǎn)藥材的氨基酸總量也較高，為68.10%，山東平邑、山東萊蕪、河北衡水產(chǎn)羊角藥材氨基酸含量相近。氨基酸含量應(yīng)作為羊角藥材質(zhì)量的內(nèi)在控制指標(biāo)。

羊角；PITC-HPLC；氨基酸

羊角為?？苿?dòng)物山羊（Capra hircusLinnaeus）或綿羊（Ovis ariesLinnaeus）的角，具清熱、鎮(zhèn)驚、解毒之功效，用于小兒發(fā)熱驚癇、風(fēng)熱頭痛、煩躁失眠及腫毒。始載于《本草新編》，《本草綱目》亦曾載：“山羊似羚羊”［1］。

羊角目前被收錄于山東省藥材標(biāo)準(zhǔn)，但只有性狀鑒別，沒有規(guī)定成分檢查項(xiàng)目，內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)需要完善，相關(guān)的研究也極少。較多的是山羊角作為羚羊角的替代物及簡(jiǎn)單藥理作用的研究，以及關(guān)于山羊角水分、灰分、浸出物、磷脂含量及山羊角提取物氨基酸含量等方面的研究［2－5］。

在我國大多數(shù)地區(qū)，羊角一般被廢棄。但羊角藥源充足，價(jià)格低廉，為了合理有效利用并進(jìn)一步完善羊角藥材標(biāo)準(zhǔn)，本文對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的羊角藥材進(jìn)行氨基酸含量研究，以期為羊角藥材質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所，異硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈、乙酸鈉和甲醇均為色譜純，娃哈哈純凈水。

2014年3月收集四川、河北衡水、山東菏澤、山東萊蕪和山東平邑羊角藥材，經(jīng)鑒定，均為牛科動(dòng)物山羊（Capra hircusLinnaeus）或綿羊（Ovis arisLinnaeus）的角。曬干后磨粉，待用。

1.2 測(cè)定方法

參照張波［6］的方法，分別制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液。準(zhǔn)確稱取10 mg樣品于安瓿管中，加入濃度為6 mol／L的HCl溶液10 mL，充氮封管，移入110℃恒溫箱中水解22 h，取出冷卻；吸取20μL水解液于1.5 mL離心管中，真空干燥備用。加衍生劑異硫氰酸苯酯（PITC）進(jìn)行柱前衍生。選用Agilent TC-C18柱色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），梯度洗脫，流動(dòng)相A為0.1 mol／L乙酸鈉（pH＝6.50）：乙腈＝93：7；流動(dòng)相B為乙腈：水＝4：1；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：36℃，進(jìn)樣量為10μL。利用外標(biāo)校正曲線法計(jì)算氨基酸含量。流動(dòng)相的洗脫見表1。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品氨基酸PITC-HPLC檢測(cè)圖分析

5個(gè)產(chǎn)地羊角藥材樣品氨基酸的出峰順序與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序相同，樣品氨基酸的出峰時(shí)間也與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間接近，見圖1。以山東菏澤樣品為例，17種氨基酸的出峰時(shí)間（min）分別為：2.72、3.05、5.86、6.42、6.61、7.95、8.87、9.50、10.07、14.76、15.57、16.29、17.33、17.79、18.00、19.19、20.42（見表2）。

2.2 不同產(chǎn)地樣品氨基酸含量比較

5個(gè)產(chǎn)地羊角藥材的氨基酸含量見表2，由表2可以看出，5個(gè)產(chǎn)地的羊角藥材總氨基酸含量差異顯著，四川省樣品氨基酸總量高達(dá)94.3%；山東菏澤樣品氨基酸總量也較高，為68.10%；山東萊蕪、山東平邑、河北省樣品氨基酸總量分別為25.5%、37.58%、27.9%。除色氨酸外，四川省樣品蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸7種人體必需的氨基酸含量為28.32%，山東菏澤樣品為19.95%，山東萊蕪和河北省樣品接近，分別為6.41%和6.8%。

5個(gè)產(chǎn)地羊角藥材中天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸含量差異顯著。河北省、山東萊蕪樣品組氨酸含量較低（≤0.01%），來自山東菏澤的樣品組氨酸含量最高（1.38%），為前二者的138倍；四川省樣品組氨酸含量為0.78%，是山東平邑樣品組氨酸含量的5.6倍。這幾類氨基酸加熱易分解［7］，因此在山羊角藥材干燥過程中應(yīng)嚴(yán)格控制干燥時(shí)間和溫度。

作為一種半必需氨基酸，精氨酸在5個(gè)羊角藥材樣品中的含量也有差異。四川省樣品中含量最高，山東菏澤樣品精氨酸含量也較高，山東萊蕪、河北樣品中精氨酸含量較低，兩產(chǎn)地樣品精氨酸含量無差異。

由此可見，各地藥材氨基酸含量同中存異。可以根據(jù)實(shí)際需要氨基酸種類，正確使用不同產(chǎn)地藥材。

表2 不同產(chǎn)地羊角藥材樣品HPLC氨基酸出峰順序及含量Table 2 Peak order andcontent of amino acids for Caprae seu ovis cornu from5 different production areas

3 討論與結(jié)論

檢測(cè)氨基酸的方法較多，常采用衍生化間接分析。衍生劑不同，測(cè)定時(shí)間、穩(wěn)定性和出峰順序均有所不同。本文采用衍生劑異硫氰酸苯酯（PITC）進(jìn)行柱前衍生測(cè)定氨基酸，5個(gè)產(chǎn)地羊角藥材中17種氨基酸的出峰順序一致，出峰時(shí)間接近，與張波［6］、于京平［8］等采用此法測(cè)定時(shí)的氨基酸出峰順序相同。而采用2，4-二硝基氯苯（DNFB）進(jìn)行柱前衍生，李娜［9］與楊清林等［10］的結(jié)果有差別。PITC-HPLC可用于測(cè)定氨基酸及其含量。測(cè)定氨基酸含量，尤其是氨基酸作為控制藥材內(nèi)在質(zhì)量的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)選取穩(wěn)定性更高的測(cè)定方法。

氨基酸是構(gòu)成人體最基本的物質(zhì)之一，具有廣泛的生理活性。有研究證實(shí)谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸和賴氨酸能夠有效提高機(jī)體的免疫功能。組氨酸可減輕癲癇發(fā)作的程度，對(duì)幼兒和尿毒癥患者來說為必需氨基酸。色氨酸具有防霉、消毒及抗氧化等作用，還可鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗高壓以及促進(jìn)睡眠，是一類天然的營養(yǎng)素［11］。本研究在提取氨基酸時(shí)用酸水解，色氨酸被破壞，故無法檢出。色氨酸是否為羊角藥理作用發(fā)揮過程中重要的氨基酸還有待進(jìn)一步研究，山羊角中復(fù)合氨基酸起主要藥理作用。所研究的5個(gè)產(chǎn)地的這5種氨基酸的總量分別為四川（31.94%）＞山東菏澤（26.31%）＞山東平邑（9.75%）＞河北衡水（7.37%）＞山東萊蕪（6.57%）。是這5種氨基酸還是總氨基酸對(duì)羊角藥效起作用？控制藥材質(zhì)量的是氨基酸總量還是幾種主要氨基酸？如果是幾種主要的氨基酸，氨基酸的種類組成及含量如何？這些均需做深入研究。

文中5個(gè)產(chǎn)地氨基酸含量比較表明，山東菏澤和四川樣品氨基酸含量遠(yuǎn)高于其他3個(gè)樣品，最高值為最低值的2.67倍，其他3個(gè)樣品的氨基酸含量相近。氨基酸含量應(yīng)作為羊角藥材質(zhì)量的內(nèi)在控制指標(biāo)。

［1］山東省食品藥品監(jiān)督管理局.山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［M］.2012版.濟(jì)南：山東省科技出版社，2013：93－96.

［2］任伯穎，曲朋，康馨元，等.不同產(chǎn)地山羊角水分和浸出物研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2014，34（5）：489－490，510.

［3］曲朋，趙好冬，龍宇，等.不同產(chǎn)地山羊角藥材灰分測(cè)定研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2014，34（6）：606－608.

［4］姜清華，翟延君，王笑康，等.羚羊角與其他羊角磷脂含量比較［J］.實(shí)用藥物與臨床，2006，9（5）：278－279.

［5］劉紹勇，薛東升，李江海，等.山羊角提取物中氨基酸的種類研究與含量測(cè)定［J］.中南藥學(xué)，2014，12（3）：271－274.

［6］張波.栝樓根部形態(tài)發(fā)育及其藥用品質(zhì)形成研究［D］.濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2013.7

［7］李江海，王伯初，王建，等.山羊角提取物中焦谷氨酸含量測(cè)定研究［J］.藥物分析雜志，2011，31（8）：1567－1570.

［8］于京平.栝樓果皮生藥學(xué)研究［D］.濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué).2014.

［9］李娜.貝類中氨基酸、脂肪酸和重金屬的含量分析及其產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［10］楊清林，傅亞.山羊角提取物中氨基酸含量測(cè)定［J］.中藥材，2011，34（7）：1023－1026

［11］梁曉慶.絞股藍(lán)蛋白質(zhì)、氨基酸含量測(cè)定及其相關(guān)性分析［D］.西安：陜西師范大學(xué)，2012.

Amino acid comparative study of Caprae seuovis cornu from five different production areas

SHI Yan，LIU Qian，ZHANG Yong-qing，LI Jia*
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

We employed PITC-HPLC to detec t amino acidcomposition andcontent of Cap rae seu ovis cornu from 5 different produc tion areas to provide the foundation for the imp rovement of its quality standard．Results show that the standardamino acidsolution andamino acidHPLC of Cap rae seu ovis cornu from5 different areas have consistent peak order andsimilar peak time．PITC-HPLC can be usedto detec t amino acidcontent．The totalamino acidconcentration of Cap rae seu ovis cornu fromSichunis 94．3%，much higher than that of other 4 samp les，and many kinds of amino acidconcentration are higher．Amino acidconcentration of the sample from Shandong Heze is 68．10%．Only slight difference exists for the amino acidconcentration of the other three samples from Laiwu，PingyiandHengshui．Amino acidcontent shouldbe usedas an internal parameter to control the quality of Caprae seu ovis cornu．

Cap rae seu ovis cornu；PITC-HPLC；am ino acid

R284.1

A

1002-4026（2014）05-0014-04

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.05.003

2014-08-17

國家科技重大專項(xiàng)（2010ZX09401-302-5-12）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2008GG2NS02022）

石巖（1988－），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與質(zhì)量控制。

*通訊作者，李佳，女，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與質(zhì)量控制。Email：ljytl7172＠163.com