張瓊 楊利紅 蘇蕊

復(fù)方頭孢克洛膠囊處方源于德國(guó)藥物目錄（Pharm Ndex）收載的MUCO Panoral-250，馬丁代爾藥典（Martndale）也收載了頭孢克洛的多組分制劑（Multiingrendient Preparation），Ger（ 德 國(guó) ）：MUCO Panoral，具有抗感染、止咳祛痰等功效[1-3]。本實(shí)驗(yàn)建立以乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（22：78）為流動(dòng)相HPLC方法，同時(shí)測(cè)定復(fù)方制劑中頭孢克洛和溴己新的含量、含量均勻度及溶出度，其專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，可更有效地控制藥品質(zhì)量[4-6]。

1 材料

1.1 儀器 島津2010A HCT液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，工作站），Satorius CP2115天平。

1.2 試藥與試液 頭孢克洛（批號(hào)：130481-200904）、鹽酸溴己新（批號(hào)：100427-200301），上述對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈：色譜級(jí)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Milli-Q Plus超純水系統(tǒng)）制備。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Shield RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（22：78）；流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)：以溴己新計(jì)為11 215；分離度：頭孢克洛與溴己新的分離度為36.14。該色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方頭孢克洛膠囊HPLC色譜圖

2.2 試驗(yàn)方法 取本品20粒，精密稱取其內(nèi)容物（約相當(dāng)于頭孢克洛50 mg），置100 mL量瓶中，加甲醇30 mL溶解，超聲15 min助溶，冷卻至室溫，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液；取鹽酸溴己新對(duì)照品約32 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加入精密稱取的頭孢克洛對(duì)照品約50 mg，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

3 方法學(xué)考察

3.1 含量均勻度的測(cè)定

3.1.1 含量均勻度線性試驗(yàn) 精密稱取鹽酸溴己新對(duì)照品22.95 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液2 mL，置50 mL量瓶中，加入精密稱取的頭孢克洛對(duì)照品124.41 mg加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液3、4、5、6、7、9 mL置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的溶液，按照上述色譜條件依法測(cè)定，以濃度與其峰面積進(jìn)行線性回歸，結(jié)果頭孢克洛和鹽酸溴己新回歸方程分別為：Y=19 702X+46 386，r=1.0000；Y=28 912X+1334.2，r=1.0000。線性范圍分別為280.97~842.90 μg/mL和11.00~33.01μg/mL。

3.1.2 精密度試驗(yàn) 精密量取含量測(cè)定項(xiàng)下的對(duì)照品溶液20 μL，按照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算頭孢克洛和鹽酸溴己新峰面積的RSD分別為0.11%和0.24%。試驗(yàn)結(jié)果表明本方法的精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為13020401的復(fù)方頭孢克洛膠囊內(nèi)容物各6份，分別按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果頭孢克洛和溴己新含量（標(biāo)示量%，n=6）分別為101.3%和99.6%，RSD分別為0.09%和0.91%。

3.1.4 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取鹽酸溴己新對(duì)照品16、20 mg和24 mg分別置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液2 mL，置10 mL量瓶中，分別加入精密稱取的頭孢克洛40、50 mg和60 mg，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液（低、中、高濃度溶液各平行制備3份）；另取已測(cè)知頭孢克洛和溴己新含量的批號(hào)為13020401的復(fù)方頭孢克洛膠囊內(nèi)容物約16 mg（n=9），分別置50 mL量瓶中，精密加入各濃度水平的儲(chǔ)備液2.5 mL，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。結(jié)果復(fù)方頭孢克洛膠囊中頭孢克洛低、中、高3種濃度的平均回收率（n=3）分別為99.8%（RSD=0.25%）、100.1%（RSD=0.35%）和100.3%（RSD=0.86%），溴己新低、中、高3種濃度的平均回收率（n=3）101.2%（RSD=0.47%）、100.9%（RSD=0.68%）和100.4%（RSD=0.98%）。

3.1.5 溶液的穩(wěn)定性考察 取含量測(cè)定下的供試品溶液，按上述色譜條件，在0、2、4、8、12、25 h依法測(cè)定頭孢克洛和溴己新的峰面積，結(jié)果RSD（n=6）分別為0.60%和0.53%，表明溶液中頭孢克洛和溴己新在25 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.6 含量均勻度考察 應(yīng)用本文建立的HPLC含量測(cè)定方法，進(jìn)行兩個(gè)批號(hào)分別為13020401和131108的復(fù)方頭孢克洛膠囊中溴己新含量均勻度檢查。取供試品1粒，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，按照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定，同時(shí)按復(fù)方頭孢克洛膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，以氯仿為溶劑，采用紫外分光光度法在252 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溴己新的含量均勻度[7-8]。兩種方法測(cè)定的結(jié)果有明顯差異，見(jiàn)表1。

表1 溴己新含量均勻度測(cè)定結(jié)果

3.2 溶出度測(cè)定

3.2.1 溶出實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合《中國(guó)藥典》2010年版二部中頭孢克洛膠囊[9]，鹽酸溴己新片與復(fù)方頭孢克洛膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)YBH04602003中溶出度的方法[8]，照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄XC第一法，以水900 mL為溶劑，轉(zhuǎn)速為100 r/min，依法操作，測(cè)定了兩批復(fù)方頭孢克洛膠囊的溶出曲線，經(jīng)5、15、30、45、60 min時(shí)取溶出液10 mL，用有機(jī)膜濾過(guò)[9]，至少棄去初濾液5 mL，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取頭孢克洛與鹽酸溴己新對(duì)照品各適量，制成相應(yīng)濃度對(duì)照品溶液，照2.1色譜條件，精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各50 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，計(jì)算頭孢克洛和溴己新不同時(shí)間的溶出量。溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30 min，6粒膠囊中頭孢克洛平均溶出量達(dá)到90%以上，溴己新平均溶出量達(dá)到70%以上，6粒膠囊中頭孢克洛與溴己新的溶出曲線見(jiàn)圖2~3。

3.2.2 溶出度線性關(guān)系試驗(yàn) 取鹽酸溴己新對(duì)照品20.70 mg置10 mL量瓶中，加乙醇5 mL溶解，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液2 mL置25 mL量瓶中，加入精密稱取頭孢克洛對(duì)照品125.50 mg，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液3、4、5、8 mL和10 mL置100 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的溶液，按照2.1色譜條件，精密量取50 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度與其峰面積進(jìn)行線性回歸，結(jié)果頭孢克洛和鹽酸溴己新回歸方程分別為：Y=18 166X+3 737 535，r=0.9991；Y=63 769X-30 211，r=0.9991。線性范圍分別為141.71~472.38 μg/mL和4.83~14.53 μg/mL。

圖2 頭孢克洛溶出曲線圖

圖3 溴己新溶出曲線圖

3.2.3 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取鹽酸溴己新對(duì)照品16 mg、20 mg和24 mg分別置20 mL量瓶中，加適量乙醇（每2 mg加乙醇1 mL）溶解，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液2 mL，置25 mL量瓶中，分別加入精密稱取的頭孢克洛50、62和74 mg，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液（低、中、高濃度溶液各平行制備3份）；另取已測(cè)知頭孢克洛和溴己新含量的批號(hào)為13020401的復(fù)方頭孢克洛膠囊內(nèi)容物約16 mg（n=9），分別置100 mL量瓶中，精密加入各濃度水平的儲(chǔ)備液5 mL，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，按2.1色譜條件，精密量取50 μL注入液相色譜儀，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。結(jié)果復(fù)方頭孢克洛膠囊中頭孢克洛低、中、高3種濃度的平均回收率（n=3）分別為99.6%（RSD=0.22%）、100.0%（RSD=0.50%）和100.2%（RSD=0.64%），溴己新低、中、高3種濃度的平均回收率（n=3）100.8%（RSD=0.72%）、101.3%（RSD=0.88%）和99.9%（RSD=0.47%）。

3.2.4 溶液的穩(wěn)定性考察 取30 min溶出液作為供試品溶液，按上述色譜條件，在0、2、4、8、12 h依法測(cè)定頭孢克洛和溴己新的峰面積，結(jié)果RSD（n=5）分別為0.34%和0.55%，表明溶液中頭孢克洛和溴己新在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 濾膜的吸附作用 取30 min溶出液，分別將原液，無(wú)機(jī)膜過(guò)濾棄去1、2、5 mL初濾液后的溶出液與有機(jī)膜過(guò)濾棄去1、2、5 mL初濾液后溶出液，精密量取50 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明有機(jī)膜過(guò)濾棄去5 mL初濾液的溶出液中，頭孢克洛與溴己新測(cè)定值均與原液測(cè)定值的平均偏差小于0.02%，可消除濾膜對(duì)頭孢克洛與溴己新的吸附影響。

4 討論

國(guó)內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均采用0.005 mol/L四丁基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2）-甲醇（62：38）為流動(dòng)相測(cè)定含量，該種試劑對(duì)色譜柱損傷大、系統(tǒng)平衡時(shí)間長(zhǎng)，本文選用磷酸鹽溶液為流動(dòng)相，大幅減少對(duì)色譜柱的損傷，頭孢克洛與溴己新不僅可同時(shí)檢出，且分離良好[10-12]。

本文采用HPLC法檢測(cè)溴己新的均勻度，成功避免了原標(biāo)準(zhǔn)中有毒揮發(fā)性試劑-氯仿的使用，具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，同時(shí)保護(hù)了檢驗(yàn)人員的健康。

本文方法可同時(shí)測(cè)定頭孢克洛和溴己新的溶出度，較原標(biāo)準(zhǔn)中僅能檢測(cè)頭孢克洛單一組分的溶出量，可進(jìn)一步提高該產(chǎn)品質(zhì)量控制。

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