鄭鳴,王老七,邊傳周,王永芬

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程系,河南鄭州450011）

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型河南地方株ORF4的克隆及原核表達(dá)

鄭鳴,王老七,邊傳周,王永芬

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程系,河南鄭州450011）

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的基因組序列設(shè)計(jì)引物,采用PCR技術(shù)從病料基因組DNA中擴(kuò)增出PCVⅡ河南地方株ORF4基因,全長(zhǎng)180 bp,編碼59個(gè)氨基酸.將該基因克隆至載體pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-ORF4表達(dá)載體.經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定后,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá).SDS-PAGE結(jié)果顯示：ORF4能夠在大腸桿菌中表達(dá),產(chǎn)物的分子量約為32 kD,且以包涵體形式存在.Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,純化后的ORF4蛋白能夠與鼠抗6×His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),為進(jìn)一步研究PCVⅡORF4蛋白的特性與功能奠定了基礎(chǔ).

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型；ORF4基因；原核表達(dá)

豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus,PCV）是一種無(wú)囊膜單鏈環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒[1],分為2個(gè)血清型：PCVⅠ和PCVⅡ,其中PCVⅡ具有致病性,是一種重要的病原微生物,能夠引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）和增生性壞死性肺炎（PNP）等多種疾病[2-4].由于PCVⅡ在我國(guó)豬群普遍存在以及持續(xù)感染而引起豬群免疫抑制,PCVⅡ與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病毒（PRV）等病原體混合感染的現(xiàn)象嚴(yán)重[5],給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害,影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展.

序列分析表明,PCVⅡ基因組全長(zhǎng)約1.7 kb,存在11個(gè)潛在開(kāi)放讀框（ORF1～ORF11）.其中,ORF1編碼參與病毒復(fù)制Rep蛋白,與PRRSV共感染中發(fā)揮重要作用[6-7]；ORF2編碼病毒的衣殼蛋白Cap,是PCVⅡ主要致病基因,可誘導(dǎo)免疫保護(hù),是基因工程疫苗研制的主要候選基因[8-10]；ORF3編碼一種非結(jié)構(gòu)蛋白,具有誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡的功能[11-12],可能與病毒致病性有關(guān)；其他8個(gè)開(kāi)放讀框（ORF4～ORF11）編碼的蛋白質(zhì)功能尚不清楚.雖然PCVⅡ病毒基因組很小,編碼框有限,但到目前為止人們對(duì)PCVⅡ病毒致病的基因數(shù)量以及致病的分子機(jī)制仍不太清楚.本試驗(yàn)利用PCR技術(shù)從采自河南省周邊縣市的疑似PMWS病料中擴(kuò)增全長(zhǎng)的ORF4基因,并將ORF4基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）以實(shí)現(xiàn)ORF4的高效表達(dá),為進(jìn)一步研究PCVⅡ病毒致病的分子機(jī)理和ORF4蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源豬病料組織由鄭州牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院大成動(dòng)物生物技術(shù)研究院取自河南省衛(wèi)輝、商丘等地3個(gè)豬場(chǎng)疑似PMWS病死豬.

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和試劑大腸桿菌BL21（DE3）和表達(dá)載體pGEX-4T-1由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室徐輝博士惠贈(zèng)；T/A克隆pMD-18-T、Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000購(gòu)自Takara公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、膠回收試劑盒及質(zhì)粒DNA小提試劑盒購(gòu)自北京天根；其他試劑均為分析純?cè)噭?

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料基因組DNA的制備取疑似PMWS病料的淋巴結(jié)組織0.1 g,用PBS沖洗1～2次,加入600 μL組織勻漿緩沖液,研磨形成勻漿,8 000 r/min離心2 min,棄上清；向沉淀中加入600 μL組織裂解液（含蛋白酶K,終質(zhì)量濃度50 μg/mL）,55℃消化過(guò)夜；冷卻至室溫,用等體積的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提1次,吸取上層水相；加入1/10體積3 mol/L NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇,室溫沉淀5 min,12 000 r/min離心5 min,棄上清；用70%乙醇洗滌沉淀,12 000 r/min離心2 min,棄上清；沉淀干燥后溶于30 μL TE緩沖液,-20℃保存.

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及ORF4基因的擴(kuò)增參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中PCVⅡ中國(guó)株基因組序列（DQ195679.1）設(shè)計(jì)1對(duì)引物,上游引物為：5’-CCCTCGAG TTA GTGGTGGTGGTGGTGGTG AGGACAACGGAGTGACCT GT-3’；下游引物為：5’-CGGGATCCATGACGTGTACATTAGTCTTCC 3’,其中下劃線(xiàn)部分為BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)的序列,下劃線(xiàn)且斜體部分序列為6×His標(biāo)簽序列,以方便重組蛋白純化,引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成.以病料基因組DNA為模板擴(kuò)增ORF4基因180 bp的編碼框.PCR擴(kuò)增條件如下：PCR循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃20 s,52℃20 s,72℃20 s,30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min.PCR擴(kuò)增結(jié)束后,進(jìn)行電泳檢測(cè),膠回收純化PCR產(chǎn)物,并通過(guò)T/A克隆連接到載體pMD-18T形成pMD-18T-ORF4質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆子送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定.

1.2.3 表達(dá)載體pGEX-4T-3-ORF4的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)將“1.2.2”中經(jīng)測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒用BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切,回收酶切小片段,與經(jīng)相同酶雙酶切的表達(dá)載體pGEX-4T-3連接,構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-4T-3-ORF4,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,PCR篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).表達(dá)條件：37℃, 180 r/min將重組菌振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0時(shí),加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L,誘導(dǎo)4 h,取少量表達(dá)菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,檢測(cè)ORF4蛋白表達(dá)情況.

1.2.4 重組蛋白的純化取誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液,離心收集菌體沉淀,用冰冷的PBS洗滌菌體1次,按1∶10（m/V）的比例用裂解緩沖液（20mmol/LPB,150mmol/LNaCl,pH7.4）重懸菌體,冰浴條件下超聲波破碎,8000 r/min, 4℃離心30 min,吸棄上清,沉淀即為融合蛋白包涵體；之后,依次用0.5%Triton X-100和1 mol/L尿素洗滌包涵體；最后,用變性液（20 mmol/L PB,150 mmol/L NaCl,6 mol/L尿素,20 mmol/L咪唑,pH 7.4）溶解包涵體,8 000 r/min,4℃離心30 min,收集上清即為純化的包涵體溶液.采用Ni+金屬螯合層析柱HisTrap HP（GE healthcare）對(duì)包涵體溶液做進(jìn)一步純化,收集150 mmol/L咪唑的洗脫峰,并進(jìn)行濃度測(cè)定和SDS-PAGE檢測(cè).

1.2.5 重組蛋白的Western Blot鑒定將SDS-PAGE電泳分離后的蛋白條帶印跡到PVDF膜上,用封閉液（1.5%BSA,TBST）封閉過(guò)夜,用TBST漂洗5次；加入鼠anti-6×His（Sigma）,37℃孵育1 h,用TBST充分洗膜；再加入HRP標(biāo)記的抗鼠二抗,37℃孵育1 h,用TBST充分洗膜；DAB避光顯色.

圖1 ORF4蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR product of ORF4

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF4基因的擴(kuò)增及序列分析

以病料基因組DNA為模板,以O(shè)RF4特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,與Marker相比,在100 bp到250 bp的位置可見(jiàn)清晰的單一條帶（見(jiàn)圖1）,與ORF4基因180 bp的長(zhǎng)度相符合.經(jīng)T/A克隆后,序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增片段的序列與模板序列（DQ195679.1）完全一致；通過(guò)NCBI中BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因與GenBank中國(guó)內(nèi)外參考毒株核苷酸同源性在98%～100%.

2.2 表達(dá)載體pGEX-4T-3-ORF4的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

用BamH I和Xho I將pMD-18T-ORF4質(zhì)粒上的ORF4切下,插入到表達(dá)載體pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-ORF4,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）.挑取單克隆進(jìn)行液體LB培養(yǎng),取少量菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,電泳結(jié)果顯示有大小為200 bp的特異性擴(kuò)增條帶（見(jiàn)圖2）,進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明克隆至原核表達(dá)載體中的ORF4基因沒(méi)有發(fā)生突變,插入方向和位置與預(yù)期一致,表明表達(dá)載體pGEX-4T-3-ORF4構(gòu)建成功.篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析表達(dá)情況,結(jié)果顯示ORF4基因在大腸桿菌中都能高效表達(dá),產(chǎn)物大小約32 ku,與預(yù)期相符,而未誘導(dǎo)的對(duì)照則沒(méi)有相應(yīng)條帶（見(jiàn)圖3）.

圖2 重組菌液的PCR鑒定Fig.2 Identification of ORF4 recombinant E.coli by PCR

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)ORF4蛋白表達(dá)及純化結(jié)果Fig.3 The detection results of expression and purification of ORF4 protein by SDS-PAGE

2.3 重組蛋白ORF4的純化

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲波破碎、包涵體洗滌和包涵體變性溶解等純化步驟后獲得重組蛋白包涵體溶液,再經(jīng)Ni+柱純化,收集洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè),純度達(dá)到90%以上（見(jiàn)圖3）,采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.325 g/L.

2.4 重組蛋白ORF4的Western Blot鑒定

圖4 Western Blot結(jié)果Fig.4 The result of Western Blot

將純化的重組蛋白ORF4經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后,印跡至PVDF膜上進(jìn)行Western Blot分析,結(jié)果顯示重組蛋白ORF4能與鼠anti-6×His發(fā)生反應(yīng),形成一陽(yáng)性條帶,而對(duì)照pGEX-4T-3則在相應(yīng)位置不能形成條帶（見(jiàn)圖4）,證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物即為重組ORF4蛋白.

3 結(jié)論與討論

從病毒血清學(xué)和病原學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)普遍存在PCVⅡ感染[13],由于PCVⅡ主要侵害感染豬的免疫系統(tǒng),造成感染豬群的免疫抑制,進(jìn)而導(dǎo)致豬群發(fā)生各種疾病[14-15],由PCVⅡ感染引起的豬圓環(huán)病毒病是正在成為當(dāng)前規(guī)模化豬場(chǎng)的一種新型病毒性疾病,并呈全球化趨勢(shì),給我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,對(duì)其致病機(jī)理的研究就顯得尤為重要.

早在1998年,Hamel等人就通過(guò)軟件分析確定了ORF4基因的存在[1],但其功能研究一直比較滯后,隨著PCVⅡ的持續(xù)感染和不斷蔓延以及對(duì)PCVⅡ研究的不斷深入,ORF3、ORF4等其他編碼蛋白成為PCVⅡ致病機(jī)理研究的熱點(diǎn)蛋白.ORF4基因位于PCVⅡ基因組互補(bǔ)鏈上ORF1基因的內(nèi)部,呈逆時(shí)針?lè)较蚺帕?全長(zhǎng)由180個(gè)核苷酸構(gòu)成,編碼59個(gè)氨基酸的ORF4蛋白,而該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能目前尚不完全清楚.李增魁等[16]研究發(fā)現(xiàn),ORF4基因轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,能夠引起PK-15細(xì)胞死亡,提示ORF4蛋白對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用.基因克隆與表達(dá)是獲得蛋白并進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究的前提,本研究以PCVⅡ中國(guó)株基因組序列（DQ195679.1）設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,成功從采自周邊縣市的疑似PMWS病料中擴(kuò)增出完整的ORF4基因,序列測(cè)定結(jié)果顯示,該基因序列與模板序列完全一致,與GenBank中國(guó)內(nèi)外參考毒株核苷酸同源性在98%～100%,表明PCVⅡORF4基因高度保守.將ORF4基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-3后,該基因能夠在大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá),且表達(dá)蛋白以不容包涵體形式存在,這主要是因?yàn)楸磉_(dá)蛋白發(fā)生了錯(cuò)誤折疊而引起的.大量表達(dá)的ORF4蛋白經(jīng)超聲波破碎和離心后,獲得包涵體沉淀,采用表面活性劑洗滌和低濃度尿素洗滌包涵體可以除去較多的雜蛋白.因?yàn)樵谳d體構(gòu)建時(shí)于ORF4基因的下游事先添加了6×His標(biāo)簽,表達(dá)的ORF4蛋白上游帶有GST標(biāo)簽蛋白,下游則帶有6×His標(biāo)簽.將變性溶解的ORF4蛋白包涵體溶液于變性條件下進(jìn)行Ni+柱純化,可獲得純度達(dá)90%以上重組蛋白.經(jīng)Western Blot檢測(cè),該重組蛋白能夠與鼠anti-6×His發(fā)生特異性反應(yīng).ORF4基因在PCVⅡ病毒的致病機(jī)理中占有重要的地位,該基因的克隆與表達(dá)為深入研究ORF4的結(jié)構(gòu)與功能,進(jìn)一步揭示ORF4蛋白與PCVⅡ病毒致病的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ).

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（責(zé)任編輯：盧奇）

Cloning and prokaryotic expression of ORF4 gene of Porcine circovirus typeⅡfrom Henan strain

Zheng Ming,Wang Laoqi,Bian Chuanzhou,Wang Yongfen
（Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450011,China）

According to the genomic sequence ofporcine circovirus typeⅡ（PCVⅡ）from GenBank,a pair of specific primers were designed.The full-length PCVⅡORF4 gene of Henan strain was amplified from pathological samples suspected PCVⅡinfection by PCR,which was 180 bp in length and encoded 59 amino acids.The ORF4 gene was cloned into the vector of pGEX-4T-3 to construct recombinant plasmid pGEX-4T-3-ORF4.The recombinant plasmid confirmed by sequencing was transformed into BL21（DE3）and induced by IPTG.SDS-PAGE analysis showed that the ORF4 gene could express in E.coli BL21（DE3）and the expression prudct of ORF4 gene was about 32 kD recombinant protein,mainly in form of inclusion bodies.The results of western blot showed that the purified ORF4 protein could be specifically reacted with 6×His monclonal antibody.Cloning and prokaryotic expression of ORF4 gene were benefit to research for function and characteristics of ORF4 of PCVⅡ.

Porcine circovirus typeⅡ；ORF4 gene；prokaryotic expression

TP386

A

1008-7516（2014）04-0052-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.04.013

2014-05-14

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目（2011GGJS-192）

鄭鳴（1975-）,男,河南信陽(yáng)人,碩士,講師.主要從事畜禽疾病防治及診斷技術(shù)的研究.

王永芬（1973-）,女,河南開(kāi)封人,碩士,教授.主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究.