孫付保，王亮，2，譚玲，2，曹鈺，劉健權(quán)，張震宇

（1江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室和糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640）

在當(dāng)今社會，以可再生生物質(zhì)資源作為原料，利用生物煉制技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)生物能源和生物基產(chǎn)品（生物燃料、生物基化學(xué)品和生物基材料）已成為國際上的研究熱點，以生物質(zhì)資源為基本原料的生物煉制已漸漸凸顯其優(yōu)勢，一個全球性的產(chǎn)業(yè)革命正在朝著以碳水化合物為基礎(chǔ)的經(jīng)濟時代發(fā)展[1-2]。然而，真正的生物質(zhì)經(jīng)濟時代尚未到來，由于木質(zhì)纖維素復(fù)雜的理化組成和多級結(jié)構(gòu)的致密不均一性，致使當(dāng)前在推進(jìn)纖維質(zhì)生物煉制工業(yè)化過程中仍面臨一系列問題[3-4]，如Wyman等在分析生物煉制纖維素乙醇時認(rèn)為，纖維素乙醇的過程成本占到總成本的67%，其中原料預(yù)處理的成本最高，其次是酶生產(chǎn)和酶水解過程[5-7]。因此，探索簡單經(jīng)濟、安全高效和環(huán)境友好的木質(zhì)纖維素新型預(yù)處理過程仍然是當(dāng)前和今后一段時期值得關(guān)注的重點研究方向[8-10]。

在生物質(zhì)原料方面，適合于生物煉制的原料來源不是單一的，它涉及許多纖維質(zhì)廢棄物，這些不同種屬的原料不僅在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大組成含量不同，而且在每種組分內(nèi)部及組分之間連接結(jié)合結(jié)構(gòu)上也有很大的差異。在生物質(zhì)預(yù)處理方面，目前已經(jīng)涌現(xiàn)了很多技術(shù)[11-15]，這些預(yù)處理技術(shù)從不同方面破壞木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)。而不同種屬生物質(zhì)原料經(jīng)不同方法預(yù)處理后的差異性就更大。因而，有必要采用現(xiàn)代分析手段從組織細(xì)胞、微觀和納米分子等水平上，多尺度全方位地對木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理前、預(yù)處理后、酶解前和酶解后等各個階段進(jìn)行深入系統(tǒng)的分析表征，不僅有助于了解不同來源（種屬和預(yù)處理）纖維基質(zhì)的差異性，而且有益于理解預(yù)處理機制和優(yōu)化預(yù)處理工藝，同時對后續(xù)纖維素酶選擇、酶解工藝優(yōu)化和酶解機理都有指導(dǎo)意義。

在木質(zhì)纖維素基質(zhì)分析表征方面，目前針對木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表征的方法很多，如：纖維素表面質(zhì)地結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡（掃描和透射）和原子力顯微鏡觀察，化學(xué)結(jié)構(gòu)里關(guān)鍵性化學(xué)鍵和官能團的（近）紅外光譜法和拉曼光譜分析，晶體特征的X射線衍射（XRD）和核磁共振（NMR）檢測等。這些分析表征方法不同程度地探究了纖維素的微觀納米結(jié)構(gòu)、功能性化學(xué)基團和結(jié)晶結(jié)構(gòu)，因此分別從某個方面表征了木質(zhì)纖維素基質(zhì)復(fù)雜的組成和多級不均一結(jié)構(gòu)特點，反映了種屬和預(yù)處理后導(dǎo)致的纖維質(zhì)差異，這對了解預(yù)處理機制和纖維質(zhì)酶解機制以及優(yōu)化生物質(zhì)相關(guān)的預(yù)處理/酶解工藝都具有一定的指導(dǎo)意義。

基于此，本文著眼于目前現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，尤其電子掃描顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）應(yīng)用于木質(zhì)纖維素原料組成結(jié)構(gòu)分析表征方面的研究進(jìn)展，分析討論了這些方法在研究木質(zhì)纖維素多糖組成結(jié)構(gòu)方面的共性特征，并對個別技術(shù)應(yīng)用過程中存在問題和不足進(jìn)行了分析，最后總結(jié)出這些大型儀器分析方法應(yīng)用于木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)研究獲得的一些結(jié)論，并在此基礎(chǔ)上對未來木質(zhì)纖維素基質(zhì)的分析表征方法進(jìn)行了展望。

1 木質(zhì)纖維素基質(zhì)的SEM觀察

目前，掃描電子顯微鏡已成為木質(zhì)纖維素基質(zhì)表面結(jié)構(gòu)特征顯微觀察的重要技術(shù)手段。本文作者[16]用常壓甘油自催化預(yù)處理法處理小麥秸稈時利用 SEM 觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甘油處理后，原麥草整的齊致密結(jié)構(gòu)撕裂成單個或者體積較小的纖維束，纖維束松散細(xì)小，表面變得粗糙，呈現(xiàn)一系列不規(guī)則的微孔洞或裂痕（如圖 1）。這些結(jié)構(gòu)變化增加了纖維比表面積，增加了纖維素與酶的接觸面積，增加了酶的接觸位點及酶載荷量，從而有助于提高酶解效率。

同時，SEM方法還可用于木質(zhì)纖維素原料不同預(yù)處理效果的比較。本文作者[17]也利用 SEM 比較了麥草的常壓甘油自催化預(yù)處理和汽爆預(yù)處理方法，發(fā)現(xiàn)：常壓甘油和汽爆兩種自催化預(yù)處理方法均打破了木質(zhì)纖維類生物質(zhì)復(fù)雜致密的理化結(jié)構(gòu)，在減小纖維的平均尺寸和增加纖維表面積的同時，也提高了纖維的粗糙度；與汽爆相比，常壓甘油水溶液預(yù)處理導(dǎo)致纖維束更松散，更細(xì)小，有著更多的粗糙度和比表面積（如圖2所示）。這些SEM觀察表明，各種預(yù)處理方法均影響了木質(zhì)纖維素基質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)，但同一種預(yù)處理方法不但在不同預(yù)處理條件下對同一種木質(zhì)纖維素的預(yù)處理效果不同，同一種預(yù)處理方法在相同預(yù)處理條件下對不同種屬纖維質(zhì)原料預(yù)處理效果也不同，而且不同預(yù)處理方法即使在相同預(yù)處理條件下對同一種原料的處理效果不一樣，不同預(yù)處理方法在不同條件下處理不同基質(zhì)效果差異就更大。因此，不同種屬木質(zhì)纖維素原料、不同預(yù)處理方法和不同預(yù)處理條件下獲得纖維基質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)差異很大。

圖1 常壓甘油水溶液預(yù)處理麥草纖維表面的超微結(jié)構(gòu)觀察[16]

圖2 汽爆和常壓甘油自催化預(yù)處理麥草表面結(jié)構(gòu)的觀察[17]

另外，通過掃描電子顯微鏡還觀察到木質(zhì)素粒子再縮合或木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體（Lignincarbohydrate complex，LCC）沉積在纖維表面的現(xiàn)象（圖3、圖4）。作者早期研究[18]中對常壓甘油自催化預(yù)處理麥草纖維表面的微觀觀察發(fā)現(xiàn)，纖維基質(zhì)表面存在著一些細(xì)小斑點[圖 3(a)]，通過進(jìn)一步放大倍數(shù)[圖 3(b)、(c)]發(fā)現(xiàn)這些小斑點通常是由一些大小直徑約為0.1～0.2 μm的顆粒和/或一個長約0.2～0.4 μm的長條結(jié)塊構(gòu)成。因此，具有超微分子結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素縮合物和/或LCC可能由球形顆粒和/或塊狀物兩部分構(gòu)成：球形顆粒為預(yù)處理過程中產(chǎn)生的木質(zhì)素碎片通過再縮合而形成的木質(zhì)素粒子，塊狀物質(zhì)是包括半纖維素和纖維素及其降解物在內(nèi)的碳水化合物。

總之，利用 SEM 只是對木質(zhì)纖維素基質(zhì)表面結(jié)構(gòu)分析，獲得的信息和結(jié)果仍舊有限，仍需要借助其他理化分析手段才能進(jìn)一步獲得準(zhǔn)確信息。

2 木質(zhì)纖維素基質(zhì)的IR技術(shù)

圖3 甘油預(yù)處理麥草纖維表面的木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體（LCC）結(jié)構(gòu)[11]

圖4 汽爆玉米芯酶解前和酶解后被純化的木質(zhì)素-多糖復(fù)合體結(jié)構(gòu)[18]

表1 木質(zhì)纖維素基質(zhì)中關(guān)鍵性化學(xué)鍵或基團特征對應(yīng)的紅外光譜波數(shù)

紅外光譜已成為分析木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)和化學(xué)變化的常用方法，表1總結(jié)出木質(zhì)纖維素基質(zhì)中關(guān)鍵性化學(xué)鍵和官能團對應(yīng)的波譜。通過對各種木質(zhì)纖維素預(yù)處理前后的化學(xué)基團分析表征，定性確定木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理過程中的組成結(jié)構(gòu)變化情況，以期更好地了解預(yù)處理方法對原料的作用機制和后續(xù)酶解的影響。Kim等[19]用FT-IR分析了氨水預(yù)處理玉米秸稈組成結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)玉米秸稈含有愈創(chuàng)木基和紫丁香基兩種類型木質(zhì)素，特征吸收峰分別在1218 cm?1、1268 cm?1（愈創(chuàng)木環(huán)C—O）、1315 cm?1（紫丁香環(huán) C—O）和 1502～1600 cm?1（芳香骨架振動）；氨循環(huán)滲漏（ammonia recycle percolation，ARP）處理后玉米秸稈樣品所有木質(zhì)素吸收峰（1502～1600 cm?1）強度均比處理前明顯減弱，顯示了ARP預(yù)處理的木質(zhì)素脫除效果。這方面研究表明，IR技術(shù)可用初步判斷預(yù)處理對木質(zhì)纖維素基質(zhì)化學(xué)組成的影響，如半纖維素和木質(zhì)素脫除、纖維素/半纖維素分子內(nèi)和分子間氫鍵結(jié)合、纖維素結(jié)晶度和非結(jié)晶度比例等。

同時，IR方法還可用于不同方法預(yù)處理纖維基質(zhì)特征的比較。本文作者[17]先前對汽爆和常壓甘油自催化預(yù)處理麥草前后紅外分析表明（圖5），預(yù)處理前后基質(zhì)在1049 cm?1處由于多聚糖（纖維素和半纖維素）中C—O—C伸展引起一個強烈的窄峰；1425 cm?1是由 C—H和 O—H彎曲造成的，1382 cm?1來源于CH2和OH彎曲，在異頭區(qū)（950～700 cm?1）的899 cm?1處小尖峰代表著多聚糖中β-葡聚糖苷鍵；與原麥草纖維相比，兩種預(yù)處理麥草纖維中在1159 cm?1和1107 cm?1處分別來源于C—O反對稱橋伸展和 C—OH骨架振動的特征峰都明顯增加，原麥草纖維在1735 cm?1處的酯鍵（C=O）峰經(jīng)汽爆預(yù)處理后明顯減弱，經(jīng)常壓甘油水溶液自催化預(yù)處理后幾乎消失了；這些信息表明，在汽爆和常壓甘油自催化預(yù)處理麥草的纖維中，連接多糖和木質(zhì)素之間的阿魏酸、對羥基苯甲酸和對羥基肉桂酸等關(guān)鍵性酯鍵都被打斷，而且常壓甘油自催化預(yù)處理技術(shù)比汽爆技術(shù)更有效，能斷裂更多木質(zhì)素和多糖之間的關(guān)鍵性酯鍵。另一方面，在 1510 cm?1和1457 cm?1處的吸收波譜，分別代表著木質(zhì)素組分和芳香環(huán)的伸展，原麥草經(jīng)溫和汽爆處理在此處的吸收加強而經(jīng)常壓甘油水溶液自催化預(yù)處理吸收峰弱化成峰肩；這表明，汽爆自催化預(yù)處理后的麥草中仍然存有著殘渣木質(zhì)素，而且木質(zhì)素含量在汽爆麥草的相對含量高于在原麥草中的含量；而常壓甘油水溶液自催化預(yù)處理麥草纖維中的殘渣木質(zhì)素含量已很少，相對含量比汽爆麥草中的殘渣木質(zhì)素含量要低得多；IR分析表明，常壓甘油水溶液自催化預(yù)處理策略在脫出木質(zhì)素方面比汽爆預(yù)處理更有效。

以上研究結(jié)果表明：①FT-IR方法用于分析表征木質(zhì)纖維素基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化時，盡管有種屬和預(yù)處理方法不同，但通常有相對固定的譜帶歸屬（如表1所示）；②FT-IR能定性顯示出各種方法預(yù)處理后木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)變化信息，如乙?；摮?、半纖維素/木質(zhì)素鏈接酯鍵/醚鍵斷裂、纖維素分子內(nèi)/間氫鍵斷裂等，能初步判斷半纖維素和木質(zhì)素脫除狀況；③粗略提供纖維素分子結(jié)晶度與非結(jié)晶度比例關(guān)系，以及晶型比例等信息；④提供木質(zhì)纖維素中殘存木質(zhì)素類型的信息。這些信息為評價各種預(yù)處理方法對不同種屬木質(zhì)素預(yù)處理效果提供了有益幫助，也為初步判斷木質(zhì)纖維素后續(xù)酶解可消化性提供了幫助。然而，既然木質(zhì)纖維素可消化性與許多因素有關(guān)，因此仍需要其他分析手段繼續(xù)加深對木質(zhì)纖維素基質(zhì)特征進(jìn)行分析。

圖5 常壓甘油和汽爆自催化預(yù)處理前后麥草纖維的紅外光譜分析[17]

3 木質(zhì)纖維素基質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)的 XRD分析

X射線衍射（XRD）已經(jīng)廣泛用于分析表征不同方法預(yù)處理的各種木質(zhì)纖維素結(jié)晶度和晶體結(jié)構(gòu)的變化情況。Kim等[20]利用XRD分析了石灰水預(yù)處理玉米秸的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)石灰水處理后秸稈纖維結(jié)晶度提高可能是由于木質(zhì)素/半纖維素等非結(jié)晶組分脫除而導(dǎo)致的。同樣，Kim 等[19]通過 XRD對ARP預(yù)處理玉米秸進(jìn)行了分析，預(yù)處理后纖維結(jié)晶度指數(shù)明顯增加，認(rèn)為但該預(yù)處理并未打破纖維素分子內(nèi)/間氫鍵，而是由于脫除其中木質(zhì)素和半纖維素等非結(jié)晶成分而纖維素相對增加所導(dǎo)致的?？傊?，研究表明，目前大多數(shù)預(yù)處理，如稀酸、稀/弱堿（石灰水、ARP）和微波等并不能作用于木質(zhì)纖維素的纖維素結(jié)晶區(qū)，而是通過作用于木質(zhì)纖維素非結(jié)晶區(qū)，通過脫除木質(zhì)素或/和半纖維素等導(dǎo)致木質(zhì)纖維素結(jié)晶度相對增加。

然而，Wang等[21]利用XRD對離子液AmimCl從松木溶解提取纖維素進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，處理前松木纖維素為天然的Ⅰ型（在2θ的15°和22°出各有一個顯著峰），經(jīng)離子液溶解再生出的纖維素只在2θ的25°附近有個稍寬衍射峰，表明溶解再生產(chǎn)品為纖維素Ⅱ型；而且發(fā)現(xiàn)該離子液預(yù)處理破壞了基質(zhì)中纖維素的分子間/內(nèi)氫鍵，使纖維結(jié)晶度明顯降低。Uju等[22]最近用XRD詳細(xì)分析了兩種離子液（[Bmpy][Cl]/[Emim][OAc]）預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料（甘蔗渣和桉樹）結(jié)晶度特征，發(fā)現(xiàn)以下幾點。①預(yù)處理甘蔗渣和桉樹纖維素都具有高結(jié)晶度，屬于纖維素Ⅰ型（天然纖維素），但桉樹纖維中含有比甘蔗渣更多的晶體結(jié)構(gòu)。②離子液[Emim][OAc]處理后2種基質(zhì)中代表纖維素結(jié)晶度的峰消失或減弱，[Bmpy][Cl]處理后除結(jié)晶纖維素原峰消失或減弱外，在12°出現(xiàn)一個纖維素Ⅱ型特征的弱峰，這些衍射方式表明經(jīng)過2種離子液預(yù)處理后基質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為無定形和纖維素Ⅱ型，其中[Bmpy][Cl]處理后基質(zhì)纖維素主要以纖維素Ⅱ型狀態(tài)存在。③進(jìn)一步計算結(jié)晶度指數(shù)顯示，[Emim][OAc]預(yù)處理使桉樹纖維素結(jié)晶度指數(shù)從45%減少至21%，使甘蔗渣從42%降至30%，[Bmpy][Cl]預(yù)處理使基質(zhì)纖維素結(jié)晶度指數(shù)減少不明顯，分別使桉樹和甘蔗渣纖維素結(jié)晶度指數(shù)降低至39%和37%，可能是由于該預(yù)處理方法主要使晶體纖維素從Ⅰ型轉(zhuǎn)化為Ⅱ型，而不是無定形狀態(tài)。④即使[Bmpy][Cl]預(yù)處理基質(zhì)具有高的纖維素結(jié)晶度指數(shù)，后續(xù)酶解發(fā)現(xiàn)這些基質(zhì)比[Emim][OAc]預(yù)處理基質(zhì)更衣水解產(chǎn)糖，初步分析可能是該預(yù)處理降低了纖維素聚合度，而纖維素分子短鏈在纖維素再生過程中轉(zhuǎn)化為符合熱動力學(xué)的纖維素Ⅱ型。⑤結(jié)合酶解糖化，[Bmpy][Cl]預(yù)處理更適合用于提高木質(zhì)纖維素可酶解性。

盡管純纖維素結(jié)晶度和可消化性密切相關(guān)，但對于木質(zhì)纖維素卻很難測其真實的纖維素結(jié)晶度，所以常用 XRD測定包括無定形纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等非結(jié)晶物質(zhì)在內(nèi)整個基質(zhì)的結(jié)晶度。因此，木質(zhì)纖維素預(yù)處理后結(jié)晶度大小和可消化性并沒有直接對應(yīng)關(guān)系，利用 XRD分析木質(zhì)纖維素基質(zhì)結(jié)晶度（結(jié)晶度指數(shù)）變化不能反映基質(zhì)的可酶解性，對后續(xù)酶水解無明顯指導(dǎo)意義，但它測得纖維素Ⅱ型的晶體尺寸指標(biāo)可能對評估木質(zhì)纖維素可酶解性具有參考價值[12，16]。

4 木質(zhì)纖維素的13C NMR結(jié)構(gòu)解析

除XRD外，NMR是研究木質(zhì)纖維素基質(zhì)里纖維素晶體結(jié)構(gòu)特征最合適的分析手段之一。由于13C NMR對于纖維素分子內(nèi)部排列更靈敏，所以它測出的結(jié)晶度指數(shù)與 XRD會有所不同，它測得的結(jié)晶度指數(shù)能更準(zhǔn)確地反映纖維素晶體實際排列[23]。纖維素NMR光譜中最有意義區(qū)域是一個分布于80～92的C4信號簇，其中有序86～92區(qū)域?qū)儆诰wⅠ型（α，β）纖維素和次晶纖維素；無序80～86區(qū)域較寬，屬于無定形纖維素、纖維束表面的結(jié)晶纖維素和/或半纖維素。Wang等[21]利用13C NMR分析研究了離子液體處理前后松樹纖維質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)原松樹包括所有纖維素和木質(zhì)素的特征吸收峰，但離子液體預(yù)處理后結(jié)晶纖維素在C4（89）和C6（62）的特征吸收峰消失，僅剩下無定形纖維素在C4（84）和C6（62）的特征吸收峰，證明原松樹復(fù)雜致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形結(jié)構(gòu)；再生纖維素光譜僅剩下纖維素和半纖維素吸收峰，沒有木質(zhì)素吸收峰；松樹殘渣的光譜具有更高分辨率和木質(zhì)素特征吸收峰（133、125和113），3個木質(zhì)素吸收峰重疊在一起并且形成了更廣闊的吸收峰。該分析證明了離子液體預(yù)處理不僅能破壞木質(zhì)纖維素中結(jié)晶纖維素的結(jié)合氫鍵，并且還作用于木質(zhì)素芳香環(huán)并使其溶解。Zhang等[23]利用13C NMR研究了不同預(yù)處理前后甜高粱晶體結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合水解結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)離子液和石灰水處理使基質(zhì)纖維素結(jié)晶度減小，而稀酸和汽爆處理會使結(jié)晶度增加；離子液預(yù)處理會導(dǎo)致纖維素發(fā)生轉(zhuǎn)型，基質(zhì)纖維素結(jié)晶度從天然Ⅰ型（α，β）轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋涂赡苁菍?dǎo)致水解增加的重要因素；盡管結(jié)晶度指數(shù)降低和水解率提高有些關(guān)系，但結(jié)晶度指數(shù)的下降程度和纖維素水解產(chǎn)糖增加沒有必然聯(lián)系，結(jié)晶度指數(shù)并不是影響酶水解的主要因素；汽爆預(yù)處理由于使基質(zhì)中無定形纖維素和易水解的細(xì)微表面纖維素增加，使酶解同時發(fā)生在纖維素結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，從而增加了基質(zhì)的可消化性。即使對純纖維素來說，僅僅結(jié)晶度指標(biāo)也不能用來評估其可水解性。此外，與原纖維素相比，再生纖維素光譜沒有出現(xiàn)新信號，顯示離子液處理過程中沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，這和FT-IR分析結(jié)果也是一致的。最近Husson等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)，離子液體處理α纖維素后使纖維素結(jié)晶度指數(shù)從 25%下降到不到 5%，但預(yù)處理前后水解葡萄糖產(chǎn)量并沒有明顯變化；離子液[Emim]+[CH3COO]?預(yù)處理使較長纖維素結(jié)晶度指數(shù)無明顯變化，[Emim]+[MeO(H)PO2]?預(yù)處理使結(jié)晶度指數(shù)稍有下降（73%→58%），但后者卻使纖維素水解產(chǎn)糖量提高近3倍。該結(jié)果再次證明，酶水解效率和結(jié)晶度指數(shù)沒有必然的相關(guān)性，其他因素如纖維素晶型、結(jié)晶度和表面結(jié)構(gòu)（比表面積和粗糙度等）應(yīng)該對酶解也有較大影響。

比較XRD和NMR對木質(zhì)纖維素基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這兩種方法都是基于整個基質(zhì)進(jìn)行的纖維素結(jié)晶度、結(jié)構(gòu)和晶體尺寸分析，因而在C4區(qū)域會發(fā)生半纖維素和纖維素吸收峰相重疊從而影響結(jié)晶結(jié)構(gòu)測定的現(xiàn)象。因此，若基質(zhì)中半纖維素含量較高，就會使NMR分析的結(jié)晶度指數(shù)偏高而與實際不符，這就需要其他分析方法作為補充。

5 纖維基質(zhì)分析表征的新型技術(shù)

除上文所述常見的SEM表面觀察、FT-IR化學(xué)結(jié)構(gòu)分析、XRD晶體結(jié)構(gòu)分析和化學(xué)結(jié)構(gòu)13C-NMR解析外，新近也出現(xiàn)一些新型分析表征方法，如高速原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）、原位原子顯微鏡（in-situ AFM）、多尺度顯譜（multi-scale visualization）和實時相關(guān)成像（correlative imagining in real time）技術(shù)等。

Igarashi等[25]利用高速AFM實時觀察單個纖維素酶組分（CBHⅠ，CBH Ⅱ）降解結(jié)晶纖維素的過程。實驗發(fā)現(xiàn)以下幾點。①CBH Ⅰ（TrCel7A）分子在結(jié)晶纖維素表面單向滑行，在某一時刻會類似于交通堵塞一樣集體停下來，停留片刻后又繼續(xù)前進(jìn)，至于什么原因?qū)е滤麄儠袛嗤Ｏ聛恚醪酵茢嗫赡苁怯捎诮Y(jié)晶纖維素表面的粗糙不光滑導(dǎo)致纖維素酶蛋白分子交通阻塞。②采用超臨界氨法處理結(jié)晶纖維素，發(fā)現(xiàn)結(jié)晶纖維素由晶型 Ⅰ 轉(zhuǎn)變成ⅢI，該處理能明顯增加結(jié)晶纖維素表面的可用滑道數(shù)以及滑動纖維素酶數(shù)目，這是因為結(jié)晶纖維素ⅢI表面有更多纖維素酶蛋白分子相作用的結(jié)合位點。③CBH Ⅱ（TrCel6A）單獨提前處理或與 CBH Ⅰ（TrCel7A）同時水解結(jié)晶纖維素ⅢI都會導(dǎo)致纖維素表面滑動酶分子數(shù)的顯著增加。因此，通過理化預(yù)處理或其他酶協(xié)同作用改進(jìn)結(jié)晶纖維素表面結(jié)構(gòu)狀態(tài)，如修平表面、脫除障礙物、增加滑道數(shù)和進(jìn)出口數(shù)等，將有助于改進(jìn)酶蛋白分子的滑動狀態(tài)，避免阻塞中斷，最終實現(xiàn)基質(zhì)高效降解。可見，好的預(yù)處理技術(shù)應(yīng)該將會增加結(jié)晶纖維素表面的纖維素酶分子結(jié)合位點，增加纖維素酶分子可用滑道數(shù)，最終有助于晶體纖維素高效水解。

Ganner等[26]利用in-situ AFM生動呈現(xiàn)了纖維素酶內(nèi)切β-葡聚糖苷酶（EG）和外切β-葡聚糖苷酶（CBH Ⅰ和Ⅱ）單獨/協(xié)同水解纖維素基質(zhì)的結(jié)構(gòu)動態(tài)變化過程。通過觀察發(fā)現(xiàn)，纖維素由無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)組成，其中結(jié)晶區(qū)還可分為細(xì)小的納米結(jié)晶纖維（寬度≤15 nm，長度100～300 nm）和大的微晶（100～10 μm），納米結(jié)晶纖維因末端纖維素酶結(jié)合位點相對容易暴露出來而更容易水解，甚至比無定形區(qū)域降解還快；纖維素內(nèi)/外切酶在協(xié)同水解時分工非常明確，EG和CBH Ⅱ通過脫除基質(zhì)中無序的無定形區(qū)域，從而使鑲嵌于纖維素中有序的納米晶體纖維暴露出來，然后這些納米纖維被CBHⅠ有效降解而形成為新的無定形區(qū)域；分析認(rèn)為纖維素酶協(xié)同作用是基質(zhì)形態(tài)依賴型的，該協(xié)同作用是由分別降解無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)的酶之間相協(xié)作來實現(xiàn)的，晶體尺寸和形狀是決定晶體纖維素可水解性和水解效率的重要因素。

Chundawat等[27]利用多尺度顯譜（multi-scale visualization），包括激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal fluorescence microscopy，LSCM）、拉曼光譜、AFM、SEM、TEM、NMR和化學(xué)分析電子光譜學(xué)（electron spectroscopy for chemical analysis，ESCA）等，通過成像表征氨爆預(yù)處理（AFEX）前后玉米秸細(xì)胞壁細(xì)微的形態(tài)和理化性質(zhì)變化，以期闡明該預(yù)處理方法在不從基質(zhì)上脫除木質(zhì)素和半纖維素情況下促進(jìn)基質(zhì)水解的機制。研究發(fā)現(xiàn)：AFEX首先從細(xì)胞壁部分溶解提取一部分分解產(chǎn)物（如氨基化合物、阿拉伯糖基寡木聚糖和木質(zhì)基酚類化合物），但隨著氨氣蒸發(fā)遺失，這些物質(zhì)又重新沉淀在外部細(xì)胞壁表面，導(dǎo)致細(xì)胞壁內(nèi)部形成了像隧道一樣的納米多孔網(wǎng)絡(luò)；這些納米多孔的形狀、尺寸（10～1000 nm）和空間分布決定于內(nèi)在的細(xì)胞壁部位和外在的預(yù)處理條件，氨爆玉米秸單位體積上孔徑表面積范圍在 0.005～0.05 nm2/nm3；氨爆預(yù)處理主要是通過斷裂木質(zhì)素-碳水化合物酯鍵、部分溶解和移位細(xì)胞壁提取物到細(xì)胞壁表面，而作用于細(xì)胞壁胞間層和外部次級細(xì)胞壁部位，使細(xì)胞壁形成相互貫通如隧道狀的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這大大增加了基質(zhì)的纖維素酶可及性。該研究顯示，為了促進(jìn)木質(zhì)纖維素基質(zhì)高效水解產(chǎn)糖，細(xì)胞壁充分分解并不是評價和選擇預(yù)處理必須的標(biāo)準(zhǔn)。

Ding等[28]利用新型的實時相關(guān)成像技術(shù)，包括：亮視野光學(xué)顯微鏡、共焦激光掃描顯微鏡、雙色受激拉曼散射顯微鏡和原子力顯微鏡，察看了從毫米到納米級玉米秸稈細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其被纖維素酶水解的變化過程，評估了化學(xué)預(yù)處理后細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在納米水平的變化及其對后續(xù)微生物酶降解的影響，得到以下結(jié)論。①真菌纖維素酶（cellulose）是相對較小的多酶混合物（mixture），細(xì)菌纖維素酶（cellulosome）是個體較大的多酶復(fù)合體（multi-enzyme complex）。②兩種纖維素酶消化植物細(xì)胞壁機制明顯不同，細(xì)菌纖維素酶主要作用于細(xì)胞壁表面，從細(xì)胞壁表面逐步剝離下單個微纖維束，而真菌纖維素酶除作用于表面外，還能穿過細(xì)胞壁表面孔洞或裂縫進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)部的微纖維束網(wǎng)絡(luò)，水解周邊成空洞或凹陷深坑，所以真菌纖維素酶水解效率比細(xì)菌纖維素酶要高（約5倍）。③纖維素分子疏水面是微生物酶易于結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，在初級細(xì)胞壁中疏水面是外露的，但在次級細(xì)胞壁中是被木質(zhì)素屏蔽的（薄壁細(xì)胞中部分屏蔽，厚壁纖維細(xì)胞中全部屏蔽），所以強化纖維素酶與纖維素疏水表面區(qū)域的接觸將是實現(xiàn)木質(zhì)纖維素高效降解的有效方式。④通過溫和預(yù)處理脫除木質(zhì)素發(fā)現(xiàn)，實驗中幾乎不存在木質(zhì)素的無效吸附現(xiàn)象，木質(zhì)素含量與細(xì)胞壁的纖維素酶接觸結(jié)合具有很好的負(fù)相關(guān)性，這說明木質(zhì)素的物理障礙是阻礙木質(zhì)纖維素水解的關(guān)鍵。⑤理想的預(yù)處理方法應(yīng)該是溫和的，只是從細(xì)胞壁中脫除木質(zhì)素；在盡量脫除木質(zhì)素同時，不使纖維素和半纖維素?fù)p失，也不使它們的天然質(zhì)地構(gòu)造發(fā)生變化，盡可能保持天然纖維相對松散、多孔原生狀的質(zhì)地結(jié)構(gòu)。可見，深入理解植物細(xì)胞壁化學(xué)或酶溶解機制，對于纖維素類生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化為生物燃料是非常關(guān)鍵的。

6 問題與展望

針對當(dāng)前儀器設(shè)備應(yīng)用于木質(zhì)纖維素基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)分析表征領(lǐng)域的研究進(jìn)展以及存在的問題，對新型分析表征技術(shù)在木質(zhì)纖維素預(yù)處理和酶水解階段的運用提出了如下展望。

由于適合生物煉制的原料的多樣性以及目前預(yù)處理方法的多樣性，導(dǎo)致了分析檢測問題的復(fù)雜性。單一的分析表征技術(shù)不能滿足檢測的需求。同種生物質(zhì)原料經(jīng)過不同的預(yù)處理方法處理后，當(dāng)前的分析技術(shù)可能檢測出不同甚至相反的結(jié)果；同樣，針對不同的生物質(zhì)原料，單一的分析檢測技術(shù)可以得出不同的檢測結(jié)果?；诖?，針對當(dāng)前分析表征技術(shù)存在的問題，作者認(rèn)為研究者應(yīng)結(jié)合多種分析表征技術(shù)判定預(yù)處理以及酶解效果。此外，可以采用新型分析表征技術(shù)動態(tài)觀察預(yù)處理以及酶解階段基質(zhì)的動態(tài)變化情況，更容易理解預(yù)處理及酶解機制。

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