熊燕，王禹，衛(wèi)寧，許儒祥，楊公社，龐衛(wèi)軍西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)

過表達(dá)miR-155抑制C2C12成肌分化

熊燕，王禹，衛(wèi)寧，許儒祥，楊公社，龐衛(wèi)軍
西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

為明確miR-155在C2C12成肌分化中的作用及分子機(jī)制，本研究構(gòu)建了miR-155過表達(dá)腺病毒載體，運(yùn)用過表達(dá)miR-155的腺病毒感染C2C12，并誘導(dǎo)其成肌分化。通過形態(tài)學(xué)觀察，成肌標(biāo)志基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，以及雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)預(yù)測(cè)的miR-155靶基因 (TCF4) 的驗(yàn)證，結(jié)果表明，C2C12細(xì)胞分化中，過表達(dá)miR-155明顯降低了肌管的形成，成肌標(biāo)志基因MyoG和MyHC的mRNA表達(dá)量極顯著地下降 (P＜0.01)，而MyoD差異不顯著 (P＞0.05)，成肌標(biāo)志基因蛋白檢測(cè)結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致；進(jìn)一步研究顯示miR-155與預(yù)測(cè)的TCF4基因的3' UTR 3個(gè)靶點(diǎn)(1487-1493,1516-1522,4532-4583) 中的1個(gè) (4532-4538) 結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-155顯著降低了TCF4的mRNA水平 (P＜0.05)。表明miR-155可能通過靶向TCF4抑制C2C12成肌分化。

miR-155，C2C12，成肌分化，TCF4，腺病毒

miRNA是一類長(zhǎng)度約 18–22 nt 的短鏈非編碼RNA，通過結(jié)合基因的 3' UTR調(diào)控靶基因mRNA的翻譯[1]。研究表明，許多 miRNA 是骨骼肌形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子[2]，其中miR-1、miR-133和miR-206是肌肉組織特異性miRs[3]。Dey 等發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-486通過直接與Pax7的3' UTR結(jié)合，下調(diào)Pax7的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成肌細(xì)胞分化[4]。miR-1和miR-133位于同一基因簇，能同時(shí)被轉(zhuǎn)錄，但二者功能相反，miR-1促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，抑制其增殖；而miR-133促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，對(duì)分化起抑制作用[5]。此外，miR-214[6]、miR-148a[7]和miR-378[8]也能促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，其中miR-378在成肌分化中形成了反饋環(huán)調(diào)節(jié)，其與成肌分化抗原 (Myogenic differentiation antigen，MyoD) 的內(nèi)源性抑制物(MyoR) 的3' UTR結(jié)合抑制其翻譯，同時(shí)MyoD與miR-378基因啟動(dòng)子近端結(jié)合，引起miR-378染色質(zhì)重組和反式激活[8]。同時(shí)成肌分化也受到miRNA的負(fù)向調(diào)控，如miR-23a直接靶向肌球蛋白重鏈亞型1 (Myosin heavy chain 1，MyHC1)、MyHC2和MyHC4的3' UTR[9]；miR-146a能與Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵成員Numb的3' UTR結(jié)合抑制其翻譯，進(jìn)而抑制該信號(hào)通路促肌管形成的作用[10]。由此可見，成肌分化受到多種miRNA的共同調(diào)節(jié)，發(fā)掘新的miRNA調(diào)控成肌細(xì)胞分化機(jī)制，是從miRNA層面全面揭示肌形成機(jī)理的研究熱點(diǎn)。

miR-155是機(jī)體中重要的miRNA，參與多種生理功能，包括造血細(xì)胞的生成、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、前體脂肪細(xì)胞分化、血管平滑肌的收縮[11]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)miR-155在肌肉組織發(fā)育中起調(diào)控作用[12]，但是具體的作用及機(jī)制還需進(jìn)一步研究。基于前人的研究基礎(chǔ)，利用TargetScan、PicTar、PITASites及MIRDB等在線軟件預(yù)測(cè)miR-155的靶基因，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞因子4 (T cell factor 4，TCF4) 存在3個(gè)miR-155的潛在靶位點(diǎn)。TCF4作為經(jīng)典wnt信號(hào)通路的下游元件，正向調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化，并且促進(jìn)肌球蛋白重鏈的表達(dá)[13-14]，推測(cè)miR-155可能靶向結(jié)合TCF4，抑制其翻譯，從而抑制C2C12成肌分化。

本研究通過制備miR-155過表達(dá)腺病毒，感染C2C12細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，運(yùn)用qPCR 和Western blotting 技術(shù)檢測(cè)肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因，如MyoD、肌細(xì)胞生成素 (Myogenin，MyoG)及MyHC的表達(dá)水平，明確了miR-155在成肌分化中的作用。為探索miR-155調(diào)控成肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制，構(gòu)建TCF4的3' UTR雙熒光素酶報(bào)告載體，與miR-155過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，并進(jìn)一步檢測(cè)過表達(dá)miR-155對(duì)C2C12中TCF4的mRNA水平影響，揭示了miR-155調(diào)控C2C12成肌分化的分子機(jī)制，將為miRNA調(diào)控成肌分化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

腺病毒載體系統(tǒng)由本實(shí)驗(yàn)室保存；HEK293T、HEK293A、C2C12 細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。限制性內(nèi)切酶 (XhoⅠ和KpnⅠ)、Taq 酶和 T4 DNA連接酶 (TaKaRa)，PmeⅠ、PacⅠ(NEB)，反轉(zhuǎn)錄和qPCR 試劑盒(TaKaRa)，BCA蛋白定量試劑盒 (Beyotime)；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒(Omega)；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒 (Promega)；胎牛血清、馬血清 (HyClone)；DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶 (Gibco)；青霉素、鏈霉素(四季青公司)；TurboFect Transfection Reagent (Thermo Scientif)；MyoD 抗體 (Santa Cruz，1∶500)，MyoG抗體 (Millipore，1∶500)，MyHC抗體(Developmental Studies Hybridoma Bank, Universityof Iowa, IA，1∶500)。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)化學(xué)分析純。引物合成以及測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 miR-155成熟序列的保守性分析

在miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中，搜索小鼠、人、豬、牛、大猩猩、鯉魚、非洲爪蟾、斑馬魚、雞、狗、黑猩猩、獼猴的miR-155成熟序列，利用Clustal W軟件對(duì)序列進(jìn)行保守性分析。

1.2.2 鼠miR-155腺病毒的載體構(gòu)建、包裝與擴(kuò)繁

用帶有限制性內(nèi)切酶 XhoⅠ與 KpnⅠ序列的引物擴(kuò)增 miR-155 前體，并連接到腺病毒穿梭載體 pAdTrack-CMV 中，經(jīng) PmeⅠ線性化后，與pAd-Easy骨架載體共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，并涂于卡那霉素抗性的平板，使pAdTrack-CMV-miR-155與pAd-Easy 骨架載體重組，次日挑選菌落 (選擇最小的菌落)，堿裂解法提取質(zhì)粒，最后進(jìn)行 PacⅠ酶切與測(cè)序鑒定。構(gòu)建好的重組載體用 PacⅠ酶切線性化后，乙醇沉淀純化。將293A細(xì)胞以 2×104細(xì)胞/cm2的密度接種于 60 mm 培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合至70%–80%時(shí)，參考TurboFect說(shuō)明書，用純化的腺病毒線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞進(jìn)行包裝。待 7–14 d，整皿細(xì)胞都出現(xiàn)熒光，細(xì)胞部分脫落，分別收集上清和細(xì)胞。細(xì)胞放于凍存管中，加入1 mL培養(yǎng)基于–80 ℃和 37 ℃反復(fù)凍融3–4次，收集細(xì)胞毒，–80 ℃保存。將HEK293A細(xì)胞以 5×106細(xì)胞接種于 100 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至90%加入上清毒進(jìn)行擴(kuò)繁，36–48 h后收集細(xì)胞，以同樣的方法收集病毒，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 C2C12細(xì)胞體外成肌分化模型的建立

未分化的C2C12細(xì)胞以含有 10% FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)基 (生長(zhǎng)培養(yǎng)基, growth medium, GM) 在 37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至 80%–90%的匯合度時(shí)，換以含2%馬血清的DMEM 培養(yǎng)基 (分化培養(yǎng)基，differentiation medium，DM) 誘導(dǎo)其成肌分化。每隔2天換液，持續(xù)誘導(dǎo)5 d，以倒置顯微鏡觀察肌管的形成。

1.2.4 過表達(dá)miR-155的腺病毒感染C2C12細(xì)胞

以 5×104細(xì)胞/cm2的密度接種于 60 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞匯合到 60%–70%，棄去培養(yǎng)基，加入miR-155 腺病毒上清500 μL 和miR-155細(xì)胞毒100 μL，同時(shí)用僅表達(dá)GFP的腺病毒作為對(duì)照，并且與處理組的病毒量一致。病毒感染細(xì)胞4 h 后，換成GM，待細(xì)胞匯合至80%–90%，按實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的方案進(jìn)行誘導(dǎo)分化。1.2.5 熒光定量PCR (q-PCR)

收集細(xì)胞，用 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，并用RNA-free水溶解，分別用 1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量?jī)x檢測(cè)總 RNA 的質(zhì)量及濃度，–80 ℃保存。用U6與microRNA或oligdT與隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照 TaKaRa公司的 qPCR 說(shuō)明書，采用20 μL體系對(duì)miR-155及成肌標(biāo)志基因進(jìn)行定量分析，以U6和GADPH作為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR相關(guān)基因的引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters for real-time PCR of related gene

1.2.6 Western blotting

培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用PBS清洗3次，并用胰酶消化，收集細(xì)胞，–80 ℃保存。使用時(shí)，加入200 μL含1% PMSF (蛋白酶抑制劑) 的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，用 BCA法將蛋白定量后，用細(xì)胞裂解液調(diào)整蛋白濃度，使樣品濃度均一化。按與上清1∶4的比例加入5×上樣緩沖液，100 ℃煮沸 10 min，分裝后保存。配制蛋白質(zhì)電泳膠，吸取 20 μL 蛋白樣品上樣，電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜 (硝酸纖維素膜) 上，5%脫脂奶粉封閉 2 h，用MyoD、MyoG、MyHC與GAPDH的一抗孵育過夜，次日再用二抗孵育2 h，Bio-Rad GS-800曝光系統(tǒng)顯示結(jié)果，使用Quantity One Manuel軟件進(jìn)行灰度分析，繪制柱形圖。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

HEK293T以8×104細(xì)胞/ cm2的密度接種于24孔板。培養(yǎng)24 h后，按照TurboFect Transfection Reagent操作手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加入100 ng 的psiCHECK-2-3' UTR和900 ng pAdTrack-CMV-miR-155 或者pAdTrack-CMV載體，并設(shè)置4個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染36 h后，每孔加入500 μL的被動(dòng)裂解液，根據(jù)雙熒光素酶試劑盒說(shuō)明書，利用PerkinElmer VicTOR ×5系統(tǒng)分別檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海參熒光素酶活性。結(jié)果顯示為海參熒光素酶/螢火蟲熒光素酶活性的比值，處理組再與對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。*P＜0.05，差異顯著；**P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-155在不同物種的保守性分析

在miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中分別搜索小鼠、人、豬、牛、大猩猩、鯉魚、非洲爪蟾、斑馬魚、雞、狗、黑猩猩、獼猴的miR-155成熟序列進(jìn)行Clustal W比對(duì)。結(jié)果顯示其成熟序列在物種間存在差異，其中豬和小鼠第12位堿基為U，其余為C (圖1)。通常miR成熟序列5'端的2–8個(gè)堿基為種子序列，其與mRNA的結(jié)合很重要。但是最新的研究發(fā)現(xiàn)，種子序列附近的核苷酸變異會(huì)改變miRNA與靶位點(diǎn)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定程度 (即最低自由能大小)，從而影響其靶向作用[15-16]。因此miR-155在小鼠和豬中的靶基因可能與其他物種存在差異。此外，其他物種miR-155的成熟序列僅在3'端最后一個(gè)堿基存在缺失變異 (圖1)，其不會(huì)影響miRNA與靶基因結(jié)合物的穩(wěn)定性[16]，所以miR-155在這些物種中功能具有一定的保守性。

圖1 miR-155成熟序列在不同物種中的保守性分析Fig. 1 Conservative analysis of miR-155’s mature sequence among 13 species. “*” represent base consistent perfectly.

2.2 miR-155腺病毒載體構(gòu)建

用帶有XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的引物，以小鼠DNA為模板克隆長(zhǎng)為321 bp、含酶切位點(diǎn)序列的 pre-miR-155，并膠回收目的片段 (圖2A，泳道13)，隨后插入到 pAdTrack-CMV 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 后經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ酶切 (圖2A，泳道1–12)、測(cè)序鑒定以及pre-miR-155的穿梭載體與pAd-Easy 骨架載體重組。經(jīng) PacⅠ酶切后，出現(xiàn)一條4.5 kb的小片段和一條23 kb的大片段 (圖2B)，獲得了陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定與miRbase中序列完全一致，表明成功構(gòu)建了miR-155腺病毒重組載體。

2.3 miR-155腺病毒的載體的包裝與擴(kuò)繁

將構(gòu)建好的重組腺病毒載體 pAd-miR-155用 PacⅠ酶切后，乙醇沉淀純化，用TurboFect轉(zhuǎn)染融合率為60%–70%的HEK293A細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察，第3天有大量熒光，第6天出現(xiàn)“彗星尾”現(xiàn)象 (圖3A)，待大部分細(xì)胞脫落，表明病毒成熟，收集病毒，進(jìn)行病毒擴(kuò)繁，加毒36 h后幾乎所有細(xì)胞被病毒感染 (圖3B)，48 h觀察超過50%的細(xì)胞脫落 (圖3B)，此時(shí)是收毒的最佳時(shí)間。

圖2 pre-miR-155腺病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建Fig. 2 Construction of miR-155 adenovirus over-expression vector. (A) pAdTrack-CMV-miR-155 was identified by restriction enzyme digestion (Kpn I and Xho I). M1, M2: DNA marker; 1–12: the digested production of pAd-CMV recombinant plasmids; 13: the pre-miR-155 fragment purified by DNA gel extraction. (B) The easy vector contains pre-miR-155 digested with Pac I. M: DNA marker; 1: easy vector and pAdTrack-CMV-miR-155 recombinant plasmid; 2: pAdTrack-CMV-miR-155; 3–6: the digested production of easy vector and pAdTrack-CMV-miR-155 recombinant plasmid.

2.4 miR-155腺病毒感染C2C12細(xì)胞及其過表達(dá)效率檢測(cè)

miR-155腺病毒感染匯合率為60%–70%的C2C12細(xì)胞，并用GFP處理為對(duì)照。24 h后觀察，感染效率大約為50% (圖4A)，48 h收集細(xì)胞，提取總RNA，用特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)成cDNA，qPCR分析miR-155成熟序列的表達(dá)量，以U6作為內(nèi)參。結(jié)果顯示，過表達(dá) miR-155 后其表達(dá)量升高了8.8倍 (P＜0.01)。表明構(gòu)建的載體能在C2C12中高效表達(dá)。

2.5 過表達(dá)miR-155抑制C2C12細(xì)胞成肌分化

對(duì)腺病毒處理的C2C12細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，觀察分化第5天細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照GFP腺病毒處理5 d后，細(xì)胞正常分化，并有大量肌管形成 (圖5A)。然而，過表達(dá)miR-155細(xì)胞分化受到抑制，肌管明顯減少(圖5A)。同時(shí)，提取細(xì)胞總RNA，qPCR檢測(cè)成肌分化轉(zhuǎn)錄因子MyoD、MyoG及MyHC的表達(dá)水平，結(jié)果顯示MyoG和MyHC的mRNA水平極顯著下降 (P<0.01)，而MyoD的mRNA略

有下降，但差異不顯著 (圖5B、C和D)。Westernbloting分析蛋白表達(dá)，結(jié)果與qPCR結(jié)果一致，MyoD和MyHC蛋白表達(dá)明顯下降 (圖5E和F)。以上結(jié)果從形態(tài)學(xué)及分子水平表明過表達(dá)miR-155抑制C2C12成肌分化。

圖3 重組腺病毒載體 pAd-miR-155 的包裝與擴(kuò)繁Fig. 3 Package and amplification of recombinant adenovirus vector pAd-miR-155. (A) The third day after HEK 293A cells transfected with pAd-pre-miR-155, 30%–40% cells expressed GFP. In the sixth day, the GFP expression increased rapidly, and the shape of GFP was like a comet tail (100×). (B) The GFP expression when pAd-miR-155 proliferated in HEK 293A cells (100×).

圖4 miR-155腺病毒感染C2C12及過表達(dá)效率檢測(cè)Fig. 4 miR-155 adenovirus infected C2C12 and the efficiency of overexpression was detected. (A) C2C12 cells before being infected by adenovirus and the GFP expression in C2C12 cells infected with adenovirus containing miR-155 (40×). (B) Real-time PCR analysis mRNA expression of mature miR-155. ** P<0.01 compared with GFP group.

圖5 miR-155抑制C2C12成肌分化Fig. 5 miR-155 inhibits the C2C12 myogenic differentiation. (A) Morphometric observation of C2C12 myoblast differentiation at day 5 (100×), white arrows indicate myotubes. (B–D) Q-PCR showed the relative mRNA expression of MyoD, MyoG, and MyHC between over-expression miR-155 and GFP group. (E) The protein expressions of MyoD, MyoG and MyHC were analyzed by Western blotting at day 5 after differentiation. (F) Densitometric analysis of MyoD, MyoG and MyHC, normalized against GAPDH. ** P<0.01 compared with GFP group at the same time point.

圖 6 TCF4是miR-155的靶基因Fig. 6 TCF4 is a target gene of miR-155. (A) Three putative target sites of TCF4 were predicted by TargetScan and PicTar. (B) miR-155: TCF4 3' UTR duplex among different putative target sites. The sequence marked in red is TCF4 3' UTR, and the sequence marked in green is the mature sequence of miR-155 in mouse. mfe: minimum free energy. (C) Schematic representation of the construct used in the luciferase assay. (D and E) miR-155 directly binds to 3' UTR (4532-4538) of TCF4. HEK293T cells in 24-well plates were transfected with 3'UTR reporters (psiCHECK-1-3'UTR contains site1 and site2, psiCHECK-2-3'UTR contains site3, 100 ng) and pAdTrack-CMV-miR-155 (900 ng). Lysates were harvested 36 h after transfection, and reporter activity was measured with the dual luciferase assay. * P<0.05 compared with control.

2.6 miR-155靶基因TCF4的驗(yàn)證

利用TargetScan (http://www.targetscan.org/ vert_50/) 和PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/)等在線預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)TCF4的3'UTR有3個(gè)保守的靶向位點(diǎn) (圖6A)，該轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控肌肉發(fā)育方面有重要作用[14,17]。進(jìn)一步分析miR-155成熟序列與預(yù)測(cè)的靶向位點(diǎn)結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html)，結(jié)果顯示第3個(gè)位點(diǎn)與miR-155形成的自由能最小，結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定 (圖6B)，其可能是miR-155發(fā)揮作用的靶位點(diǎn)。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建了TCF4的雙熒光素酶報(bào)告基因載體 (圖6C)：psiCHECK-1-3' UTR (包含Site1與Site2) 和psiCHECK-2-3' UTR (包含Site 3)，分別與miR-155過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海參熒光素酶活性，并以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染包含Site3載體的熒光素酶活性明顯降低(P＜0.05) (圖6E)，而包含Site1與Site2的轉(zhuǎn)染組差異不顯著 (圖6D)，表明miR-155通過靶向結(jié)合TCF4的Site3發(fā)揮作用。

2.7 過表達(dá)miR-155下調(diào)TCF4的mRNA水平

以上驗(yàn)證TCF4是miR-155的靶基因，C2C12細(xì)胞過表達(dá)miR-155能否影響內(nèi)源TCF4的mRNA水平需進(jìn)一步研究。腺病毒感染C2C12，分別在誘導(dǎo)分化0 d、4 d收集細(xì)胞提取RNA，利用qPCR檢測(cè)TCF4的mRNA水平，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-155使得TCF4的mRNA水平顯著下降 (圖7)，表明在成肌分化過程中，TCF4受到miR-155的調(diào)節(jié)。

圖7 miR-155調(diào)節(jié)TCF4的mRNA水平Fig. 7 miR-155 regulates TCF4 at the mRNA level. Over-expressed miR-155 in C2C12 cells shows a significant decrease in the endogenous TCF4 mRNA level. ** P<0.01 compared with GFP group at the same time point.

3 討論

骨骼肌是肌肉的主要組成部分，肌細(xì)胞的分化是其生長(zhǎng)發(fā)育的前提，該生理過程非常復(fù)雜，涉及到大量基因的表達(dá)調(diào)控、信號(hào)通絡(luò)的“對(duì)話”及非編碼RNA的調(diào)節(jié)。研究表明，miRNAs 作為一種短鏈非編碼RNA，廣泛地參與了骨骼肌細(xì)胞的分化以及相關(guān)疾病的形成[2]。因此，以C2C12為細(xì)胞模型，尋找新的調(diào)控肌細(xì)胞分化的miRNA并揭示其作用的分子機(jī)理，是該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，并將為肌相關(guān)疾病的治療及家畜的分子育種提供理論基礎(chǔ)。

在本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用pcDNA3.1過表達(dá)miR-155質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，其過表達(dá)效率僅為對(duì)照組的2倍，不能滿足后期實(shí)驗(yàn)的要求，故使用miR-155的過表達(dá)腺病毒作為載體，其與逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒相比，具有安全性高、易擴(kuò)繁、滴度高、靶細(xì)胞種類多、過表達(dá)效率高、不整合到宿主基因組中等優(yōu)點(diǎn)，是基因治療研究的首選載體[18-19]。在感染實(shí)驗(yàn)中，添加了10 μg/mL 的聚凝胺，其是一種多聚陽(yáng)離子聚合物，可通過中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥，促進(jìn)病毒的吸附作用，從而提高感染效率[20]。此外，雙熒光素酶報(bào)告分析中，將靶基因的3' UTR 連接到psiCHECK-2載體上，該質(zhì)粒能同時(shí)表達(dá)螢火蟲熒光素酶和海參熒光素酶，避免了兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低，同一批次和不同批次間轉(zhuǎn)染差異大的弊端，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

MyoD是生肌調(diào)節(jié)因子 (Myogenic regulation factors，MRFs) 家族的重要成員，抑制肌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)肌肉特異基因表達(dá)，在成肌細(xì)胞形成肌管早期起關(guān)鍵作用[21-22]。在本實(shí)驗(yàn)中，C2C12細(xì)胞過表達(dá)miR-155后，MyoD的mRNA和蛋白的表達(dá)略有下降，但是差異不顯著。然而，成肌分化晚期標(biāo)志基因MyoG和MyHC的mRNA和蛋白的表達(dá)差異極顯著。表明 miR-155 在調(diào)控成肌細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，并提示miR-155 可能通過抑制早期標(biāo)志基因MyoD推遲成肌細(xì)胞的分化，并進(jìn)一步通過抑制肌肉形成的晚期標(biāo)志分子MyoG和MyHC阻遏肌肉的分化。

TCF4是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在核內(nèi)的目標(biāo)，并作為該通路的分子開關(guān)，通過β-catenin在核內(nèi)與其結(jié)合后激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt信號(hào)在胚胎發(fā)生中對(duì)肌肉的形成發(fā)揮重要作用，是肌細(xì)胞終末分化和衛(wèi)星細(xì)胞定向的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]。研究顯示C2C12細(xì)胞系阻斷β-catenin活性或通過表達(dá)顯性負(fù)向TCF4，抑制了成肌分化[14]，表明TCF4是經(jīng)典wnt通路調(diào)控成肌分化的關(guān)鍵因子。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析TCF4的3'UTR 序列上存在3個(gè)miR-155的潛在靶點(diǎn)，經(jīng)過雙熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證，Site3是與miR-155結(jié)合的有效位點(diǎn)。我們分析了miRNA與靶位點(diǎn)及附近序列形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其與Site3形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能最小，結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，這可能是Site3成為有效位點(diǎn)的一個(gè)原因，另外，miRNA結(jié)合位點(diǎn)在3′UTR區(qū)的位置和相應(yīng)位置的堿基分布，位點(diǎn)的可結(jié)合性等也與靶基因的結(jié)合存在密切相關(guān)性[16,23]。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明了miR-155能下調(diào)內(nèi)源TCF4的mRNA水平，這似乎與傳統(tǒng)觀念相矛盾：動(dòng)物細(xì)胞中miRNA僅調(diào)控靶mRNA的翻譯。但是最新研究表明富含AU的miRNA能影響mRNA的穩(wěn)定性，縮短半衰期[24-25]。經(jīng)分析，miR-155的AU含量超過50%，另外，有研究者在HeLa細(xì)胞中證明了外源miR-1和miR-155能同時(shí)降低靶基因的mRNA和蛋白水平，對(duì)于miR-233，也觀察到相似的結(jié)果[26]。所以，miR-155可能通過影響TCF4 mRNA的穩(wěn)定性來(lái)發(fā)揮靶向作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)成功制備了miR-155的過表達(dá)腺病毒，感染C2C12細(xì)胞，過表達(dá)效率提高了8.8倍，誘導(dǎo)分化后，形態(tài)學(xué)觀察肌管明顯減少，檢測(cè)成肌分化相關(guān)基因MyoG和MyHC的表達(dá)顯著下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了TCF4為miR-155的靶基因。以上結(jié)果明確了miR-155抑制C2C12成肌分化的作用，并暗示其可能通過靶向TCF4抑制肌管的形成。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effect of over-expressed miR-155 on inhibiting C2C12 myogenic differentiation

Yan Xiong, Yu Wang, Ning Wei, Ruxiang Xu, Gongshe Yang, and Weijun Pang
Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

To clarify the function and molecular mechanism of miR-155 in myogenic differentiation of C2C12, we constructed adenovirus over-expression vector of miR-155, then C2C12 cells were infected by adenovirus and induced myogenic differentiation. First, we observed the morphology of C2C12 after differentiation. Then the mRNA and protein expressions of myogenic markers (MyoD, MyoG and MyHC) were detected by qPCR and western blotting. Subsequently, the dual luciferase reporter gene assay was carried out to validate putative target gene (TCF4) of miR-155. Meanwhile, mRNA level of TCF4 was analyzed after over-expressing miR-155. The results show that over-expressed miR-155 reduced myotubes formation. Moreover, the mRNA and protein expression of MyoG and MyHC decreased significantly (P＜0.01). Further research demonstrated miR-155 bound the one (4532-4538) of three putative sites (1487-1493,1516-1522,4532-4583) of TCF4 by luciferase reporter gene assay and the mRNA level of TCF4 decreased notably (P＜0.05). The data suggest that miR-155 inhibited myogenic differentiation of C2C12 through targeted TCF4.

miR-155, C2C12, myogenic differentiation, TCF4, adenovirus

May 3, 2013; Accepted: October 9, 2013

Weijun Pang. Tel: +86-29-87091893; E-mail: pwj1226@nwsuaf.edu.cn

熊燕, 王禹, 衛(wèi)寧, 等. 過表達(dá)miR-155抑制C2C12成肌分化. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 182-193.

Xiong Y, Wang Y, Wei N, et al. Effect of over-expressed miR-155 on inhibiting C2C12 myogenic differentiation. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 182-193.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30600437), NWAFU Basic Science Research Program (No. QN2009021), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB124705), the Reproduction Technolgy of National Pork Industry Technology Systems (No. CARS-36-04).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30600437)，西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)項(xiàng)目 (No. QN2009021)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB124705)，國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 (No. CARS-36-04) 資助。

時(shí)間：2013-11-05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131105.1012.002.html