孜力汗，劉晨光，白鳳武大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024

廢糟液全循環(huán)條件下絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵

孜力汗，劉晨光，白鳳武
大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024

丙酸是以玉米為原料自絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)廢糟液全循環(huán)過程中積累的主要抑制物。基于丙酸對酵母細胞抑制機理，開發(fā)了3種廢糟液全循環(huán)條件下乙醇連續(xù)發(fā)酵工藝策略。首先根據高溫導致丙酸生成的現象，去除了物料滅菌環(huán)節(jié)，使發(fā)酵液丙酸濃度顯著降低，生物量和乙醇濃度分別提高了59.3%和7.4%。其次，以丙酸濃度達到半數抑制濃度（IC50）40 mmol/L為目標，通過擬合丙酸積累數據預測廢糟液全循環(huán)的最長運行時間，發(fā)酵裝置運行應控制在此時間范圍內。再次，較低的環(huán)境pH值提高了丙酸毒性，而實驗證明發(fā)酵液pH為5.5時，丙酸對細胞生長的抑制影響最小，因此控制發(fā)酵過程中的pH有利于弱化丙酸毒性。

自絮凝酵母，乙醇連續(xù)發(fā)酵，廢糟液全循環(huán)，丙酸抑制

我國“十五”期間開始發(fā)展燃料乙醇，先后在黑、吉、皖、豫和桂五省區(qū)建設了大型生產裝置，但自投產以來都依賴國家財政補貼運行。截止到2012年底國家的直接財政補貼已經超過100億。目前糖質和淀粉質原料生產的燃料乙醇占市場總量的90%以上，生產成本主要來自原料和能耗[1-2]，其中能耗主要來自發(fā)酵液精餾和廢糟液處理過程，特別是常用的廢糟液離心后上清液多效蒸發(fā)濃縮技術[3]。因此，廢糟液循環(huán)利用是降低其處理能耗最有效的策略。

自絮凝酵母乙醇發(fā)酵可以在發(fā)酵結束后通過沉降的方式將酵母從發(fā)酵液中分離，顯著降低精餾過程產生廢糟液的COD，為大比例乃至全循環(huán)廢糟液創(chuàng)造了良好條件[4]。然而在廢糟糟液全循環(huán)過程中，高沸點副產物會在系統(tǒng)中積累，對酵母細胞生長和乙醇發(fā)酵產生影響[5-6]。丙酸被認為是主要的抑制物[7]，主要來自于原料液化、培養(yǎng)基滅菌和發(fā)酵液蒸餾等高溫環(huán)節(jié)[8-9]。

丙酸對酵母生長的影響與其他有機酸類似。在pH值較低的條件下，多以未解離形態(tài)存在，較容易透過脂質膜進入細胞內部。在胞內pH接近中性環(huán)境下，有機酸解離釋放出質子，造成胞質酸化而使細胞死亡[10-11]。因此濃度和環(huán)境pH值是影響丙酸對酵母細胞毒性的關鍵因素。本文針對丙酸的抑制機理，通過實驗研究開發(fā)了3種廢糟液全循環(huán)絮凝酵母乙醇發(fā)酵策略，為該工藝的工業(yè)化生產和穩(wěn)定運行提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株和原料

自絮凝釀酒酵母(SPSC01)由中國微生物保藏中心保存，菌株號為0587[12]。玉米粉由中糧生化能源 (肇東) 有限公司贈送；液化酶和糖化酶由諾維信 (中國) 公司贈送。

1.2 培養(yǎng)基與發(fā)酵

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉4 g/L，蛋白胨3 g/L，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米糖化液還原糖濃度約為220 g/L，(NH4)2HPO42.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。玉米糖化液的制備采用雙酶法水解玉米粉[13]。

將種子培養(yǎng)液靜置后棄去上清液，加入100 mL 滅好菌的100 mmol/L 檸檬酸鈉溶液使絮凝酵母解絮以控制接種量，將解絮后的酵母種子按照5% (V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.3 丙酸影響實驗

以無添加為對照，將丙酸分別按照10、20、30、40、50和60 mmol/L的濃度添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4.5，溫度30 ℃，攪拌速率150 r/min，發(fā)酵36 h后檢測乙醇、殘?zhí)?、生物量濃度?/p>

通過丙酸對酵母生長的抑制率 (y) 來評價丙酸對酵母乙醇發(fā)酵的影響，計算公式如下：

其中x0和xi分別為對照組和丙酸添加組對應的菌體生物量，g (DCW)/L。

1.4 廢糟液全循環(huán)條件下絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵

在有效體積為1.5 L的攪拌式反應器中，種子擴大培養(yǎng)結束后以稀釋速率0.04 h-1流加發(fā)酵培養(yǎng)基進行連續(xù)發(fā)酵，溫度30 ℃，pH 4.2–4.5，攪拌速率150 r/min，通氣量0.05 vvm。每隔3天將收集到的發(fā)酵液進行蒸餾，得到的廢糟液全部用于玉米粉調漿制備糖化液。玉米糖化液制備好后進行過濾，清液稀釋至發(fā)酵所需還原糖濃度，并加入相應濃度營養(yǎng)鹽配制成發(fā)酵培養(yǎng)基[14]。

1.5 分析方法

乙醇和甘油濃度用Waters高效液相色譜測定[15]。還原糖采用二硝基水楊酸法測定[16]。生物量測量采用干重法[17]。丙酸和乳酸采用Dionex ICS-2500離子色譜系統(tǒng)分析[18]。

2 結果與分析

2.1 丙酸的來源及毒性

前期工作已經證明，丙酸是廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵過程積累的主要抑制物，主要來源于原料高溫處理過程。玉米粉中主要來自籽皮的半纖維素組分水解產生的戊糖及其衍生物在高溫作用下分解產生丙酸[19]。因此，高溫滅菌和蒸餾環(huán)節(jié)是丙酸的主要來源[7]。

隨著丙酸濃度的增加，對酵母生長的抑制逐漸明顯 (圖1)。丙酸濃度為40 mmol/L時對酵母生長的抑制達到約50%，因此其半數抑制濃度(IC50) 約為40 mmol/L。降低丙酸濃度可以有效弱化其對酵母細胞的抑制作用。

圖1 丙酸對絮凝酵母生長的影響Fig. 1 Effect of propionic acid on the growth of the flocculating yeast.

2.2 策略1：減少高溫處理環(huán)節(jié)

高溫有利于副產丙酸[7,20]，因此避免過程高溫操作環(huán)節(jié)可以減少丙酸生成。在乙醇發(fā)酵過程中，原料液化、糖化、滅菌和發(fā)酵液蒸餾都需要較高溫度，而滅菌又是溫度最高的環(huán)節(jié)。在滿足生產要求的前提下，去除發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌環(huán)節(jié)可以減少丙酸生成，改善乙醇發(fā)酵過程。

發(fā)酵培養(yǎng)基不經高溫滅菌直接進行乙醇連續(xù)發(fā)酵，使得廢糟液循環(huán)條件下丙酸積累量顯著降低 (圖2)，生物量積累升高了59.3%，乙醇濃度升高了7.4%，殘?zhí)菨舛冉档土?0.1% (表1)。測定乳酸濃度來評價發(fā)酵過程雜菌污染情況[21]，培養(yǎng)基不滅菌條件下發(fā)酵液乳酸含量有所增高，但總量依然較低，且經過顯微鏡鏡檢未發(fā)現大量雜菌。雖然糖醇轉化率稍有降低，但仍然可以滿足發(fā)酵需求。更重要的是，由于降低了主要抑制物丙酸的影響，發(fā)酵過程平均乙醇濃度是增高的。

乙醇工業(yè)生產過程中，醪液經高溫液化后進行預糖化，然后直接進入發(fā)酵罐，進行同步糖化發(fā)酵。液化溫度對大多數微生物都有殺滅作用，而酵母作為優(yōu)勢菌種、發(fā)酵罐中的低pH環(huán)境以及生成的乙醇可以有效抑制細菌繁殖，因此醪液不滅菌處理在乙醇發(fā)酵工業(yè)化生產中普遍使用。

2.3 策略2：控制裝置運行時間

雖然去除了滅菌環(huán)節(jié)使得丙酸生成量顯著降低，但由于酵母不代謝丙酸且丙酸沸點高不易揮發(fā)，隨著廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵長時間運行得到積累。了解丙酸積累規(guī)律，并控制廢糟液循環(huán)時間，可以使丙酸積累對酵母細胞的影響維持在較低水平。

圖2 廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵過程丙酸積累Fig. 2 Propionic acid accumulation during ethanol fermentation by the flocculating yeast under the stillage backset condition.

表1 培養(yǎng)基高溫滅菌和不經高溫滅菌條件下廢糟液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵過程主要工藝技術指標Table 1 Biomass, ethanol, residual sugars and lactic acid detected during continuous ethanol fermentation by the flocculating yeast under the stillage backset and medium with/without sterilization conditions

如圖2可以看出，培養(yǎng)基滅菌條件下丙酸積累較明顯。通過擬合并獲得了丙酸隨廢糟液循環(huán)時間積累的方程為：

Y為丙酸濃度 (mg/L)，X為發(fā)酵裝置運行時間 (h)。設定丙酸濃度不超過IC50(40 mmol/L)，按上述公式計算丙酸達到IC50時發(fā)酵裝置運行時間分別為28 d (675.8 h) 和38 d (908.7 h)。因此減少高溫滅菌環(huán)節(jié)使得發(fā)酵裝置運行時間顯著延長。

2.4 策略3：控制發(fā)酵過程pH值

丙酸作為一種有機酸，其對酵母細胞的毒性與環(huán)境pH值密切相關。圖3所示為環(huán)境pH值對酵母生長的影響。

發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別調節(jié)至3.0、4.0、4.5和5.5。在相同pH值條件下，丙酸濃度的增加對酵母生長的抑制增強。當丙酸濃度小于30 mmol/L時，不同pH值對酵母生長的影響幾乎無差異。當丙酸濃度大于IC50時，pH值減小，增加了丙酸的抑制效果。由于丙酸的pKa為4.87，當環(huán)境pH低于該值時，丙酸多以未解離形式存在并較容易進入細胞對酵母產生毒性。培養(yǎng)基pH 5.5大于丙酸pKa值，使得未解離形式丙酸量大大降低，因此控制發(fā)酵液pH在5.5比較合適。

圖3 pH值和丙酸濃度對絮凝酵母生長的影響Fig. 3 Effect of propionic acid and pH on yeast growth.

3 結論與展望

基于丙酸對酵母細胞抑制機理，提出了3種廢糟液全循環(huán)條件下乙醇連續(xù)發(fā)酵的工藝策略。首先在滿足乙醇生產要求的前提下，通過去除原料滅菌環(huán)節(jié)使丙酸的生成顯著降低；其次通過控制發(fā)酵裝置運行時間避免丙酸濃度超過IC50；再次，環(huán)境pH對丙酸的細胞毒性有重要作用，控制發(fā)酵液pH值5.5顯著弱化丙酸對酵母細胞的毒性。以上3種方法可以單獨使用，也可以同時應用以達到更好效果。

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(本文責編 郝麗芳)

Process development for continuous ethanol fermentation by the flocculating yeast under stillage backset conditions

Lihan Zi, Chenguang Liu, and Fengwu Bai
School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China

Propionic acid, a major inhibitor to yeast cells, was accumulated during continuous ethanol fermentation from corn meal hydrolysate by the flocculating yeast under stillage backset conditions. Based on its inhibition mechanism in yeast cells, strategies were developed for alleviating this effect. Firstly, high temperature processes such as medium sterilization generated more propionic acid, which should be avoided. Propionic acid was reduced significantly during ethanol fermentation without medium sterilization, and concentrations of biomass and ethanol increased by 59.3% and 7.4%, respectively. Secondly, the running time of stillage backset should be controlled so that propionic acid accumulated would be lower than its half inhibition concentration IC50(40 mmol/L). Finally, because low pH augmented propionic acid inhibition in yeast cells, a higher pH of 5.5 was validated to be suitable for ethanol fermentation under the stillage backset condition.

self-flocculating yeast, continuous ethanol fermentation, stillage backset, propionic acid inhibition

May 14, 2013; Accepted: July 1, 2013

Fengwu Bai. Tel: +86-411-84706308; Fax: +86- 411-84706329; E-mail: fwbai@dlut.edu.cn

孜力汗, 劉晨光, 白鳳武. 廢糟液全循環(huán)條件下絮凝酵母乙醇連續(xù)發(fā)酵. 生物工程學報, 2014, 30(2): 310-314.

Zi LH, Liu CG, Bai FW. Process development for continuous ethanol fermentation by the flocculating yeast under stillage backset conditions. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 310-314.

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA021205), International S&T Cooperation Program of China (No. 2013DFA60470).

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