康東紅，王燕，張洪美，馮瀟雨，曹維，王萍山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院, 山東 濟南 250014

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

OSF 1在畢赤酵母菌中的分泌表達及其生物活性

康東紅，王燕，張洪美，馮瀟雨，曹維，王萍
山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院, 山東 濟南 250014

為了研究人成骨細(xì)胞刺激因子(Human osteoblast-stimulating factor, OSF-1) 的生物學(xué)活性，構(gòu)建OSF-1高效畢赤酵母表達菌株并表達純化具有生物活性的OSF-1。首先通過全基因人工合成的方法合成人osf-1基因，并克隆至畢赤酵母分泌表達載體pPIC9K，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC9K/osf-1，線性化后電轉(zhuǎn)化酵母宿主菌GS115，構(gòu)建P. pastoris GS115/ pPIC9K/osf-1，經(jīng)MD、G418-YPD平板和PCR法篩選，獲得多拷貝轉(zhuǎn)化子。陽性表達菌株在25 ℃，經(jīng)1% 的甲醇誘導(dǎo)表達96 h，重組蛋白的表達量達到最大。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析所表達的重組蛋白約為18 kDa，與人成骨細(xì)胞刺激因子相符。表達上清經(jīng)SP-Sephadex C-50離子交換層析進行純化，得到純度達98%以上的OSF-1。Western blotting 鑒定該蛋白對人成骨細(xì)胞刺激因子抗體具有良好的抗原性。生物活性測定表明提純的OSF-1 能促進鼠成骨細(xì)胞 MC3T3-E1 的增殖和分化。利用重組畢赤酵母高效分泌表達了有生物活性的OSF-1，為進一步開展其抗骨質(zhì)疏松活性研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

OSF-1，畢赤酵母，蛋白表達，純化，生物活性

隨著社會人口老齡化，骨質(zhì)疏松(Osteoporosis, OP) 已成為世界范圍內(nèi)危害人類健康的日趨嚴(yán)重的醫(yī)療問題和社會問題。目前抗OP的藥物分為抑制骨吸收和刺激骨形成兩大類，但尚不能完全解決OP骨折這一棘手的問題。骨質(zhì)量由骨小梁的數(shù)量和其最佳立體構(gòu)象所決定。雖然促進骨形成和抑制骨吸收的藥物均可增加骨小梁的數(shù)量，但對骨小梁最佳立體構(gòu)象的形成并非理想。成熟骨小梁的構(gòu)建要經(jīng)過3個月才能完成，包括細(xì)胞分化-骨吸收-骨形成不斷的塑建，塑成網(wǎng)狀交織的立體結(jié)構(gòu)，用最小能量承載最大負(fù)荷，即最佳力學(xué)構(gòu)象。骨骼的內(nèi)部結(jié)構(gòu)決定它的質(zhì)量，但在研究骨質(zhì)疏松時，由于涉及多學(xué)科，這一關(guān)鍵點卻被忽略。只有切入到這一角度來防治骨質(zhì)疏松，才能有效地降低OP患者遠(yuǎn)期骨折的發(fā)生率，因此它必將成為骨質(zhì)疏松研究的熱點。因此，尋找及研究能改善骨小梁結(jié)構(gòu)的力學(xué)敏感性基因及其活性蛋白將成為必然。

近年發(fā)現(xiàn)人成骨細(xì)胞刺激因子(Human osteoblast-stimulating factor, OSF-1) 基因?qū)儆趧恿γ舾行曰颍瑱C械應(yīng)力在其表達中起著非常關(guān)鍵性的作用[1]，其活性產(chǎn)物OSF-1參與了骨細(xì)胞對機械應(yīng)力的應(yīng)答[2]，對骨小梁構(gòu)象有可能起重要的作用[3-4]。Moustapha等報道機械應(yīng)力可以上調(diào)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC-TERT4細(xì)胞中OSF-1的表達[5]。三點彎曲實驗發(fā)現(xiàn)osf-1基因缺失鼠中骨生物力學(xué)特性，骨的力量、韌度、彈性極限、硬度、骨量均顯著下降；X線分析皮質(zhì)骨和小梁骨的骨密度也降低。切除OSF-1缺失鼠和正常對照鼠的坐骨神經(jīng)后發(fā)現(xiàn)，正常對照鼠的骨密度嚴(yán)重下降，而OSF-1缺失鼠并未出現(xiàn)此現(xiàn)象，提示OSF-1缺失鼠不能應(yīng)答外界機械應(yīng)力[6]。盡管OSF-1對骨骼系統(tǒng)起著重要的作用[7]，但作為動力基因的表達產(chǎn)物，對骨小梁立體構(gòu)象的研究尚未見報道。

成熟的OSF-1含有136個氨基酸，富含半胱氨酸，有5對二硫鍵[8-9]。由于組織含量甚微，不可能采取提取方法，只有通過基因工程的方法通過原核或真核表達系統(tǒng)來得到OSF-1。由于原核系統(tǒng)缺乏翻譯后的加工功能，大腸桿菌表達產(chǎn)物不能正確折疊而影響其穩(wěn)定性和活性。真核表達系統(tǒng)中，哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)要求培養(yǎng)條件苛刻，操作復(fù)雜；同時表達水平不高，價格昂貴。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有表達量高、易大規(guī)模培養(yǎng)、生產(chǎn)成本低、能進行蛋白質(zhì)翻譯后修飾和生物安全性高等特點被廣泛的使用。本研究構(gòu)建重組畢赤酵母菌，使其能高效、低成本表達OSF-1，并觀察OSF-1誘導(dǎo)鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化，旨在研究OSF-1抗骨質(zhì)疏松的作用機理，并為其今后產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒

表達載體pPIC9K、E. coli JM109、畢赤酵母Pichia pastoris GS115由大連寶生物工程公司提供；MC3T3-E1鼠成骨細(xì)胞 (三代) 購于ATCC。

1.1.2 主要試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2.0、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0、TaKaRa DNA Ligation Kit 購自大連寶生物工程公司；G418購自Sigma公司；酵母提取物購自O(shè)XOID公司；多聚蛋白胨購自日本制藥株式會社；羊抗OSF1抗體 (ab10849) 購自Abcam公司；辣根酶標(biāo)記兔抗山羊抗體(ZB-2306) 購自北京中杉金橋公司；MEM EARLES、胎牛血清購自GIBCO公司；CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所；堿性磷酸酶測定試劑購自南京建成生物工程研究所。電泳成像裝置 (ImageMaster RVD) 由 Pharmacia Biotech提供。恒溫器——水浴 (YB-121) 和恒溫培養(yǎng)箱(Incubator IC600) 由YAMATO提供。脈沖裝置(E. coli Pulser) 由Bio-Rad提供。OD600細(xì)胞測定儀 (UL TRSPEC10) 由GE Healthcare BIO-Sciences提供?？焖俚鞍滓合鄬游鱿到y(tǒng)(FPLC) 由Bio-Rad提供。超濾杯超濾膜購自Millipore公司。倒置顯微鏡 (OLYMPUS IX70)由奧林巴斯提供。二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermo SCIENTIFIC) 由美國Thermo公司提供。

1.1.3 引物與培養(yǎng)基

依據(jù)NCBI公布的基因序列 (Accession No. NM_002825)，采用全基因人工合成的方法得到，測序引物、osf-1基因合成和基因測序由大連寶生物工程公司完成。 LB、YPD、YPD-G418、BMGY、BMMY、SOC等培養(yǎng)基參考 Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊。

1.2 方法

1.2.1 表達質(zhì)粒pPIC9k/osf-1的構(gòu)建

通過NCBI查詢目的基因序列(NM_002825)，獲取osf-1基因序列，用全基因人工合成的方法得到目的基因。首先合成單鏈小片段DNA，再通過PCR的方法，把單鏈小片段DNA拼接成一條完整的雙鏈DNA，在425 bp的目的基因的5′末端加入EcoRⅠ酶切位點，在3′末端加入NotⅠ酶切位點。與pMD19-T Simple，構(gòu)建pMD19/osf-1克隆質(zhì)粒。取1 μL產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E. coli感受態(tài)細(xì)胞JM109 (Code No. D9052)中，涂布平板，37 ℃過夜，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和 NotⅠ分別雙酶切pMD19/osf-1和pPIC9K，反應(yīng)條件為37 ℃、4 h，反應(yīng)體系50 μL。酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，用溴化乙錠染色。長波紫外燈下用手術(shù)刀片切下所需條帶，放入1.5 mL離心管中，稱重。用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0 回收目的基因和目的載體，并各取1 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

用TaKaRa DNA Ligation Kit (Code No. 6023)中的連接酶，將osf-1與pPIC9K重組為pPIC9K/osf-1，將其熱加入E. coli感受態(tài)細(xì)胞JM109 (Code No. D9052)中，輕輕混勻，加入800 μL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)1 h，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。取200 μL轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布含氨芐青霉素 (50 μL/mL) 的LB平板培養(yǎng)基上，室溫放置至液體吸收，37 ℃倒置培養(yǎng)12-16 h。挑選陽性菌落，LB液體培養(yǎng)基中搖菌，提取質(zhì)粒，測序。

1.2.2 pPIC9K/osf-1轉(zhuǎn)化畢赤酵母

將重組表達質(zhì)粒pPIC9K/osf-1用SacⅠ酶切使之線性化，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌 GS115。轉(zhuǎn)化菌液涂布RDB平板，30 ℃培養(yǎng)72 h，挑取單克隆，在MD平板上篩選His+表型，分別接種于G418的YPD培養(yǎng)基平板上 (G418濃度分別為0、1和4 mg/mL)，30 ℃培養(yǎng)2 d，觀察其生長，篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。挑取陽性克隆在MD及MM平板上篩選Mut+表型。用相同的方法轉(zhuǎn)化空載體作對照。本實驗所涉及的方法參照Invitrogen 公司畢赤酵母操作手冊進行(Invitrogen Corporation. A manual of methods for expression of recombinant proteins. USA)。

1.2.3 PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子

用滅菌牙簽粘取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落，使用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR (TaKaRa Code No. D304)，80 ℃變性15 min，得到酵母基因組DNA，作為模板。用GS115作為對照。用TaKaRa LA Taq Kit (TaKaRa Code No. DRR002A)，進行PCR擴增，引物為：3' AOX1(5'–3'): GGCAAATGGCATTCTGACATCC; 5' AOX1(5'–3')：GACTGGTTCCAATTGACAAGC。

擴增條件為：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。

1.2.4 重組人OSF-1蛋白的誘導(dǎo)表達

經(jīng)過驗證的高拷貝工程菌株按照Invitrogen公司的Multi-Copy Pichia Expression kit操作手冊進行發(fā)酵表達操作。將陽性克隆菌株接種在YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600＝2-4時，1%種菌液接種至含10 mL BMGY培養(yǎng)基的三角瓶中，分別于25 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=4-6時，室溫下1 500×g離心5 min，收集菌體，用50 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使OD600＝1.5，三角瓶置于25 ℃、200 r/min搖床上進行誘導(dǎo)表達。每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至濃度為1.0%，并分別在誘導(dǎo)0、12、24、36、48、72、96和120 h時取樣濃縮進行SDS-PAGE (分離膠濃度為12%) 電泳檢測，Bradford定量。

1.2.5 重組人OSF-1蛋白的分離純化

在1 L三角瓶中發(fā)酵300 mL BMMY培養(yǎng)基的工程菌株。經(jīng)截留分子量為3.5 kDa的透析膜，于4 ℃，PBS緩沖液 (pH 7.6) 中進行透析20 h，每4 h更換磷酸緩沖液。用雙蒸水洗SP-Sephadex C-50樹脂4次，磷酸緩沖液 (pH 7.6) 洗樹脂4次。樹脂除氣、裝柱，用PBS緩沖液，以1.0 mL/min的流速平衡柱子，將透析后的上清液上樣，用洗脫液 (20 mmol/L磷酸緩沖液，2 mol/L NaCl，pH 7.6) 洗脫蛋白。根據(jù)記錄儀上的洗脫曲線確定目的蛋白所在的接收試管，收集目的蛋白溶液經(jīng)Millipore超濾器 (截留分子量為10 kDa) 進行超濾 (10 000 r/min，20 min) 濃縮除鹽后，上清即為純化蛋白。將得到的蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測和Bradford定量。

1.2.6 Western blotting檢測驗證純化的重組蛋白

經(jīng)丙烯酰胺凝膠電泳后濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，條件為恒流100 mA，1 h，將PVDF膜浸入封閉液 (用TBS配制的3%的BSA)中，室溫封閉1 h。加1：2 000稀釋的羊抗OSF-1一抗 (ab10849，Abcam公司)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入1：2 000稀釋的辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗 (ZB-2306，北京中杉金橋公司)，室溫孵育1.5 h，TBST液洗膜3次，每次10 min，加DAB/Nicl2液，暗室顯影。Western blotting 方法參見《分子克隆指南》[10]。

1.2.7 CCK-8和PNPP方法檢測重組人OSF-1蛋白的生物活性

制備三代鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1單細(xì)胞懸液，每孔5×103/mL接種于兩個96孔板上，放置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將其分為陰性對照組、陽性對照組和處理組。吸去原有細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)分組加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL。陰性對照組為常規(guī)培養(yǎng)液 (90%平衡鹽培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗1 mL)。OSF-1處理組為常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)分別加入純化的重組蛋白OSF-1，濃度分別為0.1、1.0、10.0 μg/mL。陽性對照組培養(yǎng)液為常規(guī)培養(yǎng)液加甲狀旁腺激素，濃度為0.041 178 μg/mL。置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中，每24 h換一次培養(yǎng)液，連續(xù)4 d，觀察MC3T3-E1的生長。

培養(yǎng)4 d，觀察純化蛋白對細(xì)胞增殖和分化的作用，取細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL的CCK-8，培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀450 nm測定OD值。取另一個培養(yǎng)板，吸取培養(yǎng)液，PBS洗2遍，每孔加入200 μL的TritoX-100裂解液，50 min后細(xì)胞完全裂解，向其中加入緩沖液及基質(zhì)液，水浴15 min，加入顯色劑，酶標(biāo)儀492 nm測定ALP 活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pPIC9K/osf-1構(gòu)建與鑒定

EcoR/ⅠNotⅠ酶切pMD19/osf-1克隆載體及pPIC9K質(zhì)粒，如圖1所示在500 bp附近獲得清晰的目的基因條帶，在9 200 bp處獲得表達載體pPIC9K條帶。將連接后的重組質(zhì)粒pPIC9K/osf-1熱轉(zhuǎn)化至E. coli JM109，提取質(zhì)粒，測序結(jié)果表明 (圖2)，重組人osf-1基因的堿基序列與NCBI數(shù)據(jù)庫NM_002825的目的基因的堿基序列一致，表達片斷以正確的閱讀框架插入到pPIC9K的多克隆位點EcoRⅠ和NotⅠ之間。

2.2 酵母電擊轉(zhuǎn)化與表達菌株的篩選

將線性化的pPIC9K/osf-1和空載體pPIC9K分別電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌GS115后，分別涂布于MD平板上。用含不同濃度G418抗生素的YPD平板篩選后，在4 mg/mL濃度的G418平板上獲得生長良好的陽性轉(zhuǎn)化子。提取重組酵母菌基因組作為DNA模板，以酵母表達載體的通用引物AOX為引物，進行PCR鑒定，以GS115菌體為模板的擴增產(chǎn)物作為對照。圖3顯示，泳道1-4在500 bp處出現(xiàn)擴增條帶，為GS115的AOX1基因，無外源基因的插入。泳道5-8在1 000 bp處獲得清晰的目標(biāo)條帶，提示pPIC9K/osf-1正確插入酵母菌染色體。PCR結(jié)果表明osf-1基因片段成功整合到畢赤酵母組DNA中，重組酵母命名為P. pastoris GS115/ pPIC9K/osf-1。

圖1 pMD19/osf-1和pPIC9K的酶切結(jié)果Fig. 1 Enzyme digestion result of recombinant vector pMD19/osf-1 and expression vector pPIC9K. M1: λ-Hind Ⅲ digest DNA marker; 1: pPIC9K; 2: osf-1gene; M2: DL2000 DNA marker.

圖2 pPIC9K/osf-1表達載體測序鑒定Fig. 2 Sequence analysis of expression vector pPIC9K/osf-1.

圖3 重組表達菌株及空白對照PCR的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 PCR result of P. pastoris GS115/ pPIC9K/osf-1 and GS115. M: DL2000 DNA marker; 1-4: PCR of P. pastoris GS115; 5-8: PCR of P. pastoris GS115/ pPIC9K/osf-1.

圖4 畢赤酵母GS115/ pPIC9K/osf-1表達上清SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expressed OSF-1 from cultural supernatant of P. pastoris. GS115/pPIC9K/osf-1. 1–8: P. pastoris GS115/ pPIC9K/osf-1 (0, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 h); M: protein marker.

2.3 重組酵母表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

選取表達菌株接種在10 mL BMGY培養(yǎng)液中，25 ℃振蕩培養(yǎng)至 OD600= 4，離心收集菌體，再用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，在25 ℃誘導(dǎo)OSF-1蛋白表達。誘導(dǎo)表達間隔12-24 h連續(xù)取樣，共120 h，進行SDS-PAGE分析。表達上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測，誘導(dǎo)表達72 h，在約18 kDa 處有一條清晰的蛋白條帶，此條帶與預(yù)測的OSF-1蛋白的分子量大小相符合，用同樣條件誘導(dǎo)培養(yǎng)的對照無此條帶 (圖4)。以上結(jié)果表明，畢赤酵母工程菌所表達的重組蛋白為OSF-1蛋白，且其在96 h時表達量最大為82.3 μg/mL。

2.4 重組酵母表達蛋白OSF-1的純化

將OSF-1陽性表達菌株接種300 mL誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基 (pH 6.0)，在25 ℃、1%甲醇條件下誘導(dǎo)表達96 h。13 000 r/min離心除去菌體。上清液經(jīng)20 mmol/L PBS緩沖液 (pH 7.6) 透析后經(jīng)SP-Sephadex C-50樹脂純化，用洗脫液(20 mmol/L PBS緩沖液，pH 7.6，2 mol/L NaCl)洗脫蛋白。洗脫液經(jīng)過超濾除鹽濃縮后，SDS-PAGE檢測在18 kDa附近可見清晰蛋白條帶 (圖5)，Western blotting檢測純化的目的蛋白能與OSF-1抗體結(jié)合 (圖6)。通過該純化工藝，可以從每升發(fā)酵上清中獲得22.3 mg且純度大于98%的OSF-1蛋白，純化收得率為27.1%。純化后的OSF-1蛋白于-20 ℃保存。

2.5 重組酵母表達蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化

倒置顯微鏡下，接種的各組成骨細(xì)胞，最初多為圓形，植入后2 h細(xì)胞開始貼壁變形，24 h后細(xì)胞開始分化增殖，呈梭形外觀，48 h可見貼壁細(xì)胞形成團簇。隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞突起增多、延長，3 d后可見成骨細(xì)胞突起伸展 (圖7)。

圖5 SDS-PAGE鑒定純化的OSF-1Fig. 5 Identification of the purified OSF-1 by SDS-PAGE. 1: negative control; 2–3: purified OSF-1; M: protein marker.

圖6 Western blotting鑒定純化的OSF-1Fig. 6 Identification of the purified OSF-1 by Western blotting.

表1 酵母表達蛋白誘導(dǎo)MC3T3-E1增殖和分化Table 1 Proliferation and differentiation of osteoblasts MC3T3-E1 by recombinant protein OSF-1

CKK-8法觀察細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示OSF-1組處理的細(xì)胞增殖OD值高于陰性對照組(P＜0.05)。分別用濃度為0.1、1.0、10.0 μg/mL OSF-1處理細(xì)胞，呈濃度時效依賴性，細(xì)胞增殖OD值以1.0 μg/mL濃度的增殖作用最大，且較甲狀旁腺激素處理組高 (表1)。

堿性磷酸酶活性測定來觀察細(xì)胞分化，結(jié)果顯示OSF-1處理組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性顯著高于陰性對照組，但低于甲狀旁腺激素組，OSF-1處理組誘導(dǎo)細(xì)胞分化呈濃度依賴性，隨著濃度增加，堿性磷酸酶活性增高，1.0 μg/mL增高較顯著，雖然10.0 μg/mL處理后堿性磷酸酶活性繼續(xù)增高，但較緩慢 (表1)。

圖7 細(xì)胞種板3 d后的成骨細(xì)胞(×40)Fig. 7 Osteoblast of negative, OSF-1 and PTH groups after three days.

3 討論

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)起始于上世紀(jì)80年代[11]。它具有原核表達系統(tǒng)優(yōu)點，如產(chǎn)量高，可大規(guī)模生產(chǎn)，又具有分泌表達、使外源基因遺傳穩(wěn)定性好的優(yōu)勢[12]，在蛋白折疊和糖基化修飾方面優(yōu)于原核表達系統(tǒng)，更適合真核基因的生物學(xué)功能研究[13-14]。本實驗將人工合成的osf-1基因插入酵母分泌型表達載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K/osf-1，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的畢赤酵母GS115，構(gòu)建P. pastoris GS115/pPIC9K/osf-1表達菌株。

誘導(dǎo)P. pastoris GS115/pPIC9K/osf-1表達蛋白發(fā)酵實驗流程中，甲醇含量[15-16]、誘導(dǎo)時間和溫度都比較重要。甲醇濃度過高對酵母有害，過低則限制菌體生長，本實驗甲醇的誘導(dǎo)濃度為1%。一般情況下誘導(dǎo)72 h外源蛋白表達量接近最高值，誘導(dǎo)時間設(shè)定120 h。酵母的最佳生長溫度為28-30 ℃[17]。超過32 ℃，外源蛋白很難表達，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡。Jahic等認(rèn)為低溫發(fā)酵可以提高蛋白的表達量。因此將發(fā)酵過程分為兩個階段，設(shè)定一個較高溫度使菌體長到一定密度后，再調(diào)低一個溫度至蛋白表達，25 ℃及30 ℃作為誘導(dǎo)溫度。本實驗挑取G418抗性高的His+Mut+型克隆進行甲醇誘導(dǎo)表達。連續(xù)培養(yǎng)120 h，每日補充甲醇，維持濃度在1%，每12 h取樣，SDS-PAGE鑒定。24 h時，18 kDa附近目標(biāo)蛋白條帶出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間增加，外源蛋白表達量隨之增加，蛋白電泳提示72 h蛋白表達量明顯增多，以96 h表達量最多。

本實驗采用離子交換層析方法進行OSF-1純化，與其他純化蛋白的方法比較，離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同分離蛋白質(zhì)，是所有蛋白純化與濃縮方法中最有效的方法[18-19]。離子層析的分離效率高，純化后的蛋白活性高，純度高、產(chǎn)量大，且操作簡便，易于自動化，成本低廉，實用性廣。該蛋白在pH為7.6的磷酸緩沖液及蛋白洗脫液分離，保證了蛋白的活性，大多數(shù)細(xì)胞適宜在pH 7.2-7.4條件下生長，因此，純化的蛋白不影響細(xì)胞的生長環(huán)境。通過該純化工藝，可以從每升發(fā)酵上清中獲得22.3 mg且純度大于98%的OSF-1蛋白。

目前用于研究成骨細(xì)胞增殖和分化的方法主要有CCK8法[20]和ALP活性的測定。以甲狀旁腺激素作為陽性對照，0.1、1.0和10 μg/mL OSF-1三個濃度處理鼠成骨細(xì)胞，結(jié)果顯示OSF-1具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化的生物學(xué)作用，呈劑量依賴性，由0.1 μg/mL至1.0 μg/mL作用增加的幅度最大，10 μg/mL時盡管作用增加，但幅度較小。與甲狀旁腺激素比較，其增殖作用強度接近，誘導(dǎo)作用較弱。

本實驗構(gòu)建了成骨細(xì)胞刺激因子P. pastoris GS115/ pPIC9K/osf-1，通過甲醇誘導(dǎo)獲得了分泌表達的OSF-1，得到了甲醇利用性的轉(zhuǎn)化子，簡化了發(fā)酵工藝。離子層析方法獲得了高純度的OSF-1蛋白。生物活性研究顯示，純化的OSF-1蛋白能誘導(dǎo)鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化，作為動力敏感基因的蛋白，有可能成為新型抗骨質(zhì)疏松藥物，為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Liedert A, Kaspar D, Claes L, et al. Signal transduction pathways involved in mechanical regulation of HB-GAM expression in osteoblastic cells. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 342(4): 1070–1076.

[2] Albi E, Curcio F, Spelat R, et al. Loss of parafollicular cells during gravitational changes (microgravity, hypergravity) and the secret effect of Pleiotrophin. PLoS ONE, 2012, 7(12): e48518.

[3] Liedert A, Kassem M, Claes L, et al. Mechanosensitive promoter region in the human HB-GAM gene. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 387(2): 289–293.

[4] Xing W, Baylink D, Kesavan C, et al. Global gene expression analysis in the bones reveals involvement of several novel genes and pathways in mediating an anabolic response of mechanical loading in mice. J Cell Biochem, 2005, 96(5): 1049–1060.

[5] Liedert A, Kassem M, Claes L, et al. Mechanosensitive promoter region in the human HB-GAM gene. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 387(2): 289–293.

[6] Imai S, Heino TJ, Hienola A, et al. Osteocyte-derived HB-GAM (pleiotrophin) is associated with bone formation and mechanical loading. Bone, 2009, 44(5): 785–794.

[7] Tare RS, Oreffo RO, Clarke NM, et al. Pleiotrophin/Osteoblast-stimulating factor 1: dissecting its diverse functions in bone formation. J Bone Miner Res, 2002, 17(11): 2009–2020.

[8] Merenmies J, Rauvala H. Molecular cloning of 18 kDa growth-associated protein of developing brain. J Biol Chem, 1990, 265(28): 16721–16724.

[9] Meng K, Ma XH, Zhang N. Pleiotrophin interact with it’s receptors and signal transduction pathway. Life Sci Res, 2007, 11(1): 1–9 (in Chinese).孟坤, 馬曉海, 張南. 多功能生長因子PTN與受體互相作用及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo). 生命科學(xué)研究, 2007, 11(1): 1–9.

[10] Sambrook J，Russell DW. Molecular Cloning. Beijing: Science Press, 2002: 359–361 (in Chinese). Sambrook J, Russell DW. 分子克隆實驗指南. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 359–361.

[11] Hitzeman RA, Hagie FE, Levine HL, et al. Expression of human gene for interferon in yeast. Nature, 1981, 293(5835): 717–722.

[12] Lin Cereghino GP, Sunga AJ, Lin Cereghino J, et al. Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. Genet Eng, 2001, 23: 157–169.

[13] Cregg JM, Vedvick TS, Raschke WC. Recent advances in the expression of foreign in Pichia pastoris. Biotechnology, 1993, 11(8): 905–910.

[14] Nohr J, Kristiansen K, Krogsdam A. Protein expression in yeast. Methods Mol Biol, 2003, 232:111–125.

[15] Wu D, Chu J, Wang YH, et al. Influence of methanol concentration on purification recovery of consensus interferon-I produced by Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2011, 27(12): 1789–1796 (in Chinese).吳丹, 儲炬, 王永紅, 等. 甲醇濃度對畢赤酵母表達重組人復(fù)合干擾素分離純化得率的影響. 生物工程學(xué)報, 2011, 27(12): 1789–1796.

[16] Schenk J, Marison IW, von Stockar U. A simple method to monitor and control methanol feeding of Pichia pastoris fermentations using mid-IR spectroscopy. J Biotechnol, 2007, 128(2): 344–353. [17] Jahic M, Wallberg F, Bollok M, et al. Temperature limited fed-batch technique for control of proteolysis in Pichia pastoris bioreactor cultures. Microb Cell Fact, 2003, 2(1): 6.

[18] Sun YF, Zhao YP, Liu H, et al. Purification and regeneration of rhBMP-2. Chin J Cons Dentis, 2001, 11(2): 73 (in Chinese).孫葉芳, 趙艷萍, 劉晗, 等. 重組人骨形成蛋白2的純化和復(fù)性. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志, 2001, 11(2): 73.

[19] Jiang Y, Wen YJ, Liu JY, et al. Expression and purification of mouse B lymphocyte chemoattractant. J Biomed Eng, 2004, 21(2): 251–254 (in Chinese).姜愚, 文艷君, 劉繼彥, 等. 小鼠B細(xì)胞趨化因子原核表達與純化. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2004, 21(2): 251–254.

[20] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65(1/2): 55–63.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Expression and bioactivity of OSF-1 in Pichia pastoris

Donghong Kang, Yan Wang, Hongmei Zhang, Xiaoyu Feng, Wei Cao, and Ping Wang
Department of Endocrinology, Qianfoshan Hospital, Shandong University, Jinan 250014, Shandong, China

In order to research the biologic activity of osteoblast-stimulating factor 1 (OSF-1), the pPIC9K/osf-1 yeast expression vector was constructed to express and purify OSF-1. Firstly, the osf-1 gene sequence was obtained by artificial synthesis and cloned into Pichia pastoris expression vector pPIC9K to generate pPIC9K/osf-1. The recombinant plasmidwas linearized by SacⅠand transformed into P. pastoris GS115 by electroporation. Recombinant P. pastoris GS115/ pPIC9K/osf-1 was screened by MD and G418-YPD plates and further identified by PCR. The positive P. pastoris was induced with 1% methanol at 25 ℃ for 96 h.The target protein was analyzed by SDS-PAGE showing a special band about 18 kDa. The target protein was successfully purified from the supernatant of the broth using ion exchange chromatography of SP-Sephadex C-50. The purity of target protein was above 98%. Western blotting appeared a good antigenicity of the purified protein. Bioassay results show that the recombinant protein OSF-1 can promote the differentiation and proliferation of osteoblasts MC3T3-E1. We successfully expressed OSF-1 by recombinant P. pastoris for further development of anti-osteoporosis of research and industrial production of OSF-1.

OSF-1, Pichia pastoris, protein expression, purification, biological activity

April 23, 2013; Accepted: June 26, 2013

Donghong Kang. Tel/Fax: +86-531-88563805; E-mail: kdh_2010@163.com

康東紅, 王燕, 張洪美, 等. OSF 1在畢赤酵母菌中的分泌表達及其生物活性. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(2): 274-283.

Kang DH, Wang Y, Zhang HM, et al. Expression and bioactivity of OSF-1 in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 274-283.

Supported by: Shandong Young Scientists Foundation (No. 2004BS02020).

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家獎勵基金 (No. 2004BS02020) 資助。

時間：2014-01-03 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20140103.0810.001.html