閆慧芳，丁明珠，元英進(jìn)天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系 系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072

紫杉二烯人工酵母的代謝組學(xué)分析

閆慧芳，丁明珠，元英進(jìn)
天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系 系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072

為了更深入地從代謝角度研究萜類合成人工酵母的內(nèi)在差異，以紫杉二烯人工酵母為例，利用代謝組學(xué)的方法對其發(fā)酵指數(shù)中期胞內(nèi)代謝物的變化進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，與對照菌W303-1A相比，紫杉二烯的生產(chǎn)會對胞內(nèi)糖酵解、三羧酸循環(huán)中間物及一些氨基酸的含量產(chǎn)生不同程度的影響，進(jìn)而對其生長產(chǎn)生一定抑制作用。其中檸檬酸因紫杉二烯功能模塊的引入下降明顯，降幅達(dá)90%以上，因此可以作為后續(xù)功能酵母研究的標(biāo)志性代謝物。紫杉二烯人工酵母細(xì)胞代謝組的研究可以為萜類化合物異源合成的優(yōu)化提供更多的信息和幫助。

代謝組學(xué)，紫杉二烯，酵母，氨基酸，TCA循環(huán)

系統(tǒng)生物學(xué)包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等多個方面，可以用來研究生物體系在特定條件下DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝物等的相互關(guān)系和動態(tài)變化過程[1-2]。組學(xué)可以實現(xiàn)從不同層次全面探究細(xì)胞內(nèi)部的變化，并從不同角度解釋這些生物過程[3]。其中，代謝物作為細(xì)胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，其含量變化可被認(rèn)為是細(xì)胞對基因水平或外界環(huán)境變化的最終響應(yīng)，是細(xì)胞系統(tǒng)信息的表型特征[4-5]。因此，代謝組學(xué)的研究能夠更加直觀、系統(tǒng)地表達(dá)生物體系在環(huán)境中的變化。

代謝組學(xué)越來越廣泛地被應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如新藥的研發(fā)[6-7]、臟器移植監(jiān)控[8]、探究疾病發(fā)生機制[9]、發(fā)酵過程分析及優(yōu)化[10-16]、轉(zhuǎn)基因作物的分析[17]等。以往的研究工作和日趨完善的代謝組分析技術(shù)都為代謝組學(xué)研究的發(fā)展提供了借鑒和支持。

萜類化合物的酵母異源合成成為近年來研究的熱點，研究者已經(jīng)利用合成生物學(xué)成功地獲得了許多功能人工細(xì)胞[18-25]。本研究中，以紫杉二烯人工酵母為例，利用代謝組學(xué)的分析方法探究外源功能模塊對酵母底盤細(xì)胞代謝產(chǎn)生的影響，更深入地解釋外源模塊與底盤細(xì)胞相互作用，并為后續(xù)研究中人工細(xì)胞合成外源化合物的優(yōu)化提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試劑

提取液：甲醇:水=1:1，V/V (甲醇，色譜純，Merck公司，Germany)。

內(nèi)標(biāo)：以milli-Q水配制的濃度為0.2 mg/mL的氘標(biāo)記琥珀酸混合液 (Succinic d4 acid，F(xiàn)luka公司，Buchs, Switzerland)。

衍生化試劑：20 mg/mL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液 (甲氧基銨鹽酸鹽，O-methoxamine hydrochloride，色譜純，F(xiàn)luka公司，Buchs, Switzerland；吡啶，pyridine，色譜純，Sigma公司，St. Louis，MO，USA)。N-甲基-N-三甲硅烷基-三氟乙酰胺 (N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide，MSTFA，色譜純，F(xiàn)luka公司，Buchs, Switzerland)。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

原始酵母細(xì)胞W303-1A(MATa {leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15})為實驗室保存。紫杉二烯人工酵母細(xì)胞SyBE_001109、SyBE_001110和SyBE_001111均為之前研究中所構(gòu)建，它們的區(qū)別是使用的GGPPS來源不同，分別來源于紅豆杉(GGPPSbc)、釀酒酵母 (GGPPSsc) 和草生歐文氏菌 (GGPPSeh)，具體菌株信息見表1。

YPD固體培養(yǎng)基：酵母浸粉 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂粉 20 g/L。

YPD液體培養(yǎng)基：酵母浸粉 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L。

SD-drop固體培養(yǎng)基：去氨基酵母氮源6.7 g/L；drop-out氨基酸混合物 2 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂粉20 g/L。

表1 實驗使用的菌株列表Table 1 Strains used in this study

SD-drop液體培養(yǎng)基：去氨基酵母氮源6.7 g/L；drop-out氨基酸混合物2 g/L；葡萄糖20 g/L。

1.3 酵母發(fā)酵方法

將保存的陽性克隆菌在SD固體平板培養(yǎng)基上劃線篩選。挑取單克隆接入5 mL SD-drop液體培養(yǎng)基中，220 r/min、30 ℃培養(yǎng)至OD600值為4.0左右。轉(zhuǎn)接至50 mL YPD液體培養(yǎng)基(250 mL三角瓶) 中，使得初始OD600值為0.05, 200 r/min、30 ℃持續(xù)發(fā)酵至平臺期。

1.4 胞內(nèi)小分子代謝物的提取

參照Ding等[26]在研究中的提取方法。

1) 在細(xì)胞生長指數(shù)中期取發(fā)酵液2 mL，收集菌體并清洗2次, 將清洗后的細(xì)胞置于液氮中1 min淬滅。

2) 在細(xì)胞中加入1 mL甲醇-水提取液，渦旋1 min混勻；置入液氮中凍融 1 min，重復(fù)3次。

3) 12 000 r/min冷凍離心5 min，吸取上層清液于新的離心管中；下層細(xì)胞殘留物中再加入0.5 mL甲醇-水提取液，凍融3次，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液與之前收集的清液混合。

4) 殘留的酵母細(xì)胞則置于80 ℃烘箱中烘干，以稱量干重。

1.5 樣品衍生化

參照Ding等[11]在之前研究中的樣品處理方法。

在100 μL 提取液中加入10 μL內(nèi)標(biāo)混合液，混勻后真空冷凍干燥；在干燥的樣品中加入50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液，置于40 ℃水浴反應(yīng)80 min；再加入80 μL N-甲基-N-三甲硅烷基-三氟乙酰胺 (MSTFA)，置于40 ℃水浴反應(yīng)80 min，12 000 r/min離心3 min，吸取上清100 μL于樣品瓶中待檢測。

1.6 代謝物的檢測

代謝物樣品采用Waters GC-TOF-MS CAB051進(jìn)行檢測，包括安捷倫公司的7683自動進(jìn)樣器，安捷倫公司的6890氣相色譜 (GC，Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA) 和沃特世公司的飛行時間質(zhì)譜 (TOF/MS，Waters Corp.，USA)[26]。

色譜條件：DB-5MS 毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持2 min，以5 /min ℃升至290 ℃，290 ℃保持3 min；進(jìn)樣口溫度260 ℃，分流進(jìn)樣(分流比10：1)，進(jìn)樣量1 μL；恒壓模式91 kPa；色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃。

質(zhì)譜條件：EI+電離源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；溶劑延遲時間5 min；質(zhì)量掃描方式：全離子掃描。

1.7 代謝物的定性和定量分析

代謝物的定性和定量是借助Masslynx (version 4.1) 軟件完成的。將質(zhì)譜的碎片峰和NIST數(shù)據(jù)庫 (National Institute of Standards and Technology mass spectral library，2005) 比較，對色譜圖中的各個峰進(jìn)行定性。通過Masslynx軟件將總離子流圖中的各峰進(jìn)行自動積分，同時輔以手動修正，可得到各個代謝物和內(nèi)標(biāo)的原始峰面積數(shù)據(jù)。并采用內(nèi)標(biāo)法對各代謝物進(jìn)行定量，即將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積進(jìn)行比值計算，并除以相應(yīng)物質(zhì)在空白對照W303-1A中的含量 (即W303-1A中的含量均視作1)，進(jìn)而得到各代謝物的相對含量，這些代謝物的相對含量被用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。

圖1 酵母發(fā)酵過程生長曲線Fig. 1 The growth curves.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源功能模塊對人工酵母細(xì)胞生長的影響

對能合成紫杉二烯的功能人工酵母SyBE_001109(GGPPSbc),SyBE_001110(GGPPSs c)，SyBE_001111(GGPPSeh)和原始底盤W303-1A(空白對照)進(jìn)行發(fā)酵過程生長曲線的測定，4種菌株的生長曲線見圖1。

從這4種酵母的生長曲線可以看出，與W303-1A相比，在發(fā)酵初期3種紫杉二烯人工細(xì)胞的生長狀況與W303-1A差別并不明顯，而到了指數(shù)中期以后，則均顯現(xiàn)出不同程度的抑制，最終OD600值也均小于W303-1A。這可能因為在發(fā)酵的初期，紫杉二烯的濃度還很低，不會對細(xì)胞造成壓力，而隨著紫杉二烯的積累，帶給酵母細(xì)胞的壓力越來越大，就逐漸顯現(xiàn)了生長狀況受影響的現(xiàn)象。通過進(jìn)一步的比較發(fā)現(xiàn)，3種功能酵母之間的生長狀況也存在一定差異，其中SyBE_001110的生長受到的抑制最小，它的生長與空白菌W303-1A差別不大，而SyBE_001109的生長明顯受到抑制，終止OD600要比SyBE_001110低16%。在之前的研究中，3種功能酵母生產(chǎn)紫杉二烯的產(chǎn)量存在差異，其中采用紅豆杉源GGPPS的SyBE_001109產(chǎn)量最高，而采用草生歐文氏菌GGPPS和釀酒酵母GGPPS的菌株差別不大，后者紫杉二烯產(chǎn)量最低。因此，這3種功能酵母生長狀況的差異恰好與紫杉二烯產(chǎn)量的差異一致，因此也同樣證明了紫杉二烯對于酵母細(xì)胞生長的影響，而濃度越高，影響越大。但需要指出的是，紫杉二烯對細(xì)胞的生長并未起到很大的抑制作用，因此在酵母密度可以接受的前提下，還是可以選擇效果更好的外源模塊，實現(xiàn)高產(chǎn)紫杉二烯的目的。

2.2 糖酵解路徑相關(guān)氨基酸分析

糖酵解和TCA循環(huán)屬于細(xì)胞的中心碳代謝環(huán)節(jié)，其代謝流較大，且其中的關(guān)鍵中間代謝物乙酰CoA是參與包括TCA循環(huán)在內(nèi)的諸多生物催化的重要前體[27]，同時糖酵解中的代謝物也是一些氨基酸合成的前體，糖酵解路徑、TCA循環(huán)、相關(guān)氨基酸合成及紫杉二烯合成途徑的代謝網(wǎng)絡(luò)見圖3，可見糖酵解可以視為MVA途徑的一個上游路徑，而TCA循環(huán)可以視為MVA途徑的競爭路徑。因此分析糖酵解和TCA循環(huán)中相關(guān)代謝物含量的變化，有助于分析MVA路徑代謝的變化。

通過測定W303-1A底盤與3種不同來源GGPPS的外源模塊組合的3種人工酵母與糖酵解有關(guān)的氨基酸，發(fā)現(xiàn)了這3種外源模塊引入時，人工酵母細(xì)胞與原始底盤W303-1A相比發(fā)酵中代謝的變化。以糖酵解途徑中間體為前體合成的氨基酸包括絲氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、丙氨酸等(圖2)。對這4種氨基酸的測定發(fā)現(xiàn)，除了絲氨酸在SyBE_001109中的含量比空白對照W303-1A的含量高以外，其他3種菌株中各氨基酸含量均低于W303-1A的含量 (圖3)。這說明外源模塊的引入對酵母糖酵解途徑相關(guān)氨基酸的合成產(chǎn)生了一致的影響，使它們的產(chǎn)量降低，這可能由于外源模塊的引入需要占用一部分碳源進(jìn)行化合物的合成，從而使分流到各氨基酸合成的代謝流稍微降低。另外，之前有研究表明，中心代謝水平的降低可能是對不同壓力的響應(yīng)[28]，因此通過這幾種氨基酸的響應(yīng)，可以認(rèn)為紫杉二烯的存在對細(xì)胞造成了一定的壓力，從而表現(xiàn)出了代謝組上一定的表觀現(xiàn)象。

圖2 酵母中糖酵解、TCA循環(huán)及紫杉二烯合成代謝網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 Metabolic network of glycolytic pathway, TCA cycle and taxadiene synthetic pathway.

圖3 糖酵解途徑相關(guān)氨基酸含量Fig. 3 Relative contents of amino acids related to glycolytic pathway.

2.3 TCA循環(huán)相關(guān)代謝物分析

2.3.1 TCA循環(huán)直接中間代謝物分析

TCA循環(huán)是糖類、脂類、氨基酸及核苷酸等的最終代謝通路，又是這幾者代謝聯(lián)系的重要樞紐[29]。TCA循環(huán)對于細(xì)胞維持自身存活、功能十分重要。由于它以乙酰CoA為起點，因而成為MVA途徑的競爭路徑之一(圖2)。事實上，作為酵母細(xì)胞的中心碳代謝的一環(huán)，TCA循環(huán)的代謝通量一定是遠(yuǎn)大于MVA等一系列途徑的，所以一方面TCA循環(huán)代謝通量的微小差異，也可能對MVA途徑產(chǎn)生影響；另一方面，外源紫杉二烯合成途徑的引入也可能對TCA循環(huán)造成一定影響。

圖4 三種功能酵母和W303-1A中TCA循環(huán)直接代謝物含量Fig. 4 The relative contents of TCA cycle metabolites.

圖5 發(fā)酵指數(shù)中期三種功能酵母TCA循環(huán)直接代謝物橫向比較Fig. 5 TCA cycle metabolites of three functional yeast strains in log phase.

共檢測到TCA循環(huán)中間直接代謝物4種，包括檸檬酸、ɑ-酮戊二酸、琥珀酸和富馬酸，它們在4種酵母中相對含量見圖4。其他幾種TCA循環(huán)中間體未檢測出，可能因為相對含量過低。這幾種中間代謝物，規(guī)律最為明顯的是檸檬酸，在發(fā)酵指數(shù)中期，3種功能酵母中檸檬酸含量最高的也僅為W303-1A的10%，這說明外源紫杉二烯模塊的引入使檸檬酸的含量大大降低，一方面這可能由于紫杉二烯合成途徑與TCA循環(huán)產(chǎn)生了競爭關(guān)系，分走一部分代謝流，從而TCA循環(huán)的代謝通量受到一定影響，但TCA循環(huán)原本的代謝流就強于MVA路徑，所以這種影響顯然不會太大；另一方面則可能因為紫杉二烯的產(chǎn)生會產(chǎn)生抑制檸檬酸合成的效果，因此檸檬酸可以作為后續(xù)研究中研究功能酵母的標(biāo)志性代謝物。琥珀酸和富馬酸也是TCA循環(huán)的關(guān)鍵中間體，分析顯示功能酵母中琥珀酸含量比W303-1A略有下降，而富馬酸的規(guī)律并不一致，SyBE_001111中的含量反而高于W303-1A，這可能與引入模塊間的差異有關(guān)。

借助雷達(dá)圖 (圖5) 對3種功能酵母進(jìn)行橫向比較，通過所圍的面積可以明顯看出SyBE_001109中4種代謝物總量最少，這說明采用紅豆杉源GGPPS的外源模塊引入對TCA循環(huán)造成的影響最明顯，事實上，該功能酵母的紫杉二烯產(chǎn)量也是最高的，因此這說明也可能由于紫杉二烯對TCA循環(huán)有一定抑制作用。

2.3.2 TCA循環(huán)相關(guān)氨基酸的分析

TCA循環(huán)的中間體也是一些氨基酸合成的前體。對4種酵母細(xì)胞發(fā)酵指數(shù)中期與TCA循環(huán)一些相關(guān)的氨基酸進(jìn)行分析 (圖6)，其中天冬酰胺、異亮氨酸、脯氨酸和羥化脯氨酸的含量，均為功能酵母中含量低于空白酵母W303-1A，而鳥氨酸和谷氨酸則為功能酵母中含量更高，這兩種氨基酸水平提高可能與相關(guān)蛋白質(zhì)降解加速有關(guān)，有研究表明，當(dāng)細(xì)胞面對壓力時，會提高蛋白質(zhì)降解速率[28,30]。這說明外源紫杉二烯模塊的引入對這6種氨基酸的合成會造成影響，且3種功能模塊造成的影響一致，因此，這幾種氨基酸也可以作為后續(xù)功能酵母研究的標(biāo)志性代謝物。對紫杉二烯產(chǎn)量最高的SyBE_001109進(jìn)行著重的分析，發(fā)現(xiàn)它的6種氨基酸含量與W303-1A相比變化比例均是最大的 (圖6)，SyBE_001109包含了較強的紫杉二烯功能模塊，從而對各類氨基酸合成造成的影響最大，這也進(jìn)一步驗證了我們的觀點，即這6種氨基酸含量的變化確實由于紫杉二烯合成模塊的引入而導(dǎo)致，同時，較強的功能模塊對氨基酸合成的影響更大。

圖6 三種功能酵母和W303-1A中TCA循環(huán)相關(guān)氨基酸含量Fig. 6 Relative contents of related amino acids of TCA cycle.

3 結(jié)論

通過對紫杉二烯功能酵母與W303-1A在發(fā)酵過程中的代謝組學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)，紫杉二烯功能模塊的引入會對酵母細(xì)胞的代謝產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而對生長產(chǎn)生一定的抑制效果，且紫杉二烯產(chǎn)量越高，這種抑制相對越明顯。與空白W303-1A相比，紫杉二烯功能酵母中與糖酵解相關(guān)的氨基酸含量大部分都有所降低，這說明紫杉二烯模塊的引入對糖酵解相關(guān)氨基酸的合成產(chǎn)生一定影響。

紫杉二烯功能酵母中TCA循環(huán)中檸檬酸的含量與W303-1A相比有明顯降低，降低幅度達(dá)90%以上，這說明外源模塊的引入會對檸檬酸的含量造成巨大影響，因而檸檬酸可以發(fā)展為后續(xù)功能酵母研究中的一個標(biāo)志性代謝物。此外，TCA循環(huán)相關(guān)的6種氨基酸也不同程度地增多或減少，且功能模塊越強，這種影響越明顯，因此這些氨基酸也可以作為后續(xù)功能酵母研究中的標(biāo)志性代謝物。

代謝組學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)人工酵母內(nèi)部代謝物變化規(guī)律，提供更多外源模塊與底盤細(xì)胞相互作用的信息，因而可以發(fā)展為萜類化合物異源合成研究中通用的策略。本文為合成生物學(xué)研究中外源功能模塊與底盤細(xì)胞如何更好適配提供了新的思路和方法。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Metabolomics analysis of taxadiene producing yeasts

Huifang Yan, Mingzhu Ding, and Yingjin Yuan
Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering & Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China

In order to study the inherent difference among terpenes producing yeasts from the point of metabolomics, we selected taxadiene producing yeasts as the model system. The changes of cellular metabolites during fermentation log phase of artificial functional yeasts were determined using metabolomics methods. The results represented that compared to W303-1A as a blank control, the metabolites in glycolysis, tricarboxylic acid cycle (TCA) cycle and several amino acids were influenced. And due to the changes of metabolites, the growth of cells was inhibited to a certain extent. Among the metabolites identified, citric acid content in taxadiene producing yeasts changed the most, the decreasing amplitude reached90% or more. Therefore, citric acid can be a marker metabolite for the future study of artificial functional yeasts. The metabolomics analysis of taxadiene producing yeasts can provide more information in further studies on optimization of terpenes production in heterologous chassis.

metabolomics, taxadiene, yeast, amino acid, TCA cycle

May 9, 2013; Accepted: July 8, 2013

Mingzhu Ding. Tel: +86-22-27406491; Fax: +86-22-27403888; E-mail: mzding@tju.edu.cn

閆慧芳, 丁明珠, 元英進(jìn). 紫杉二烯人工酵母的代謝組學(xué)分析. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(2): 223-231.

Yan HF, Ding MZ, Yuan YJ. Metabolomics analysis of taxadiene producing yeasts. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 223-231.

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA02A701), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB721105).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (No. 2012AA02A701)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2012CB721105) 資助。