楊秀芳， 王改利， 馬養(yǎng)民， 張 鑫， 劉建軍

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

0 引言

水楊梅(Geumaleppicum)為薔薇科(Rosaceae)水楊梅屬多年生草本植物，主要分布于我國(guó)西北、華北、東北、西南等地區(qū)[1].作為傳統(tǒng)中藥，民間以其全草或根入藥，具有清熱解毒、利尿、消腫止痛之功效[2].水楊梅的化學(xué)成分主要有三萜、黃酮、鞣質(zhì)[3-5]，該類化合物主要用于抗HIV(艾滋病毒)活性、抗HSV(皰疹病毒)活性[6，7].1994年，McCutcheon AR等[8]報(bào)道了水楊梅屬植物GeummacrophyllumWilld. var.macrophyllum的甲醇提取物具有抑制微生物生長(zhǎng)的作用.其同屬近緣植物Geumrivale也顯示出抗微生物的活性[9]，結(jié)果表明其中的三萜類成分活性最強(qiáng)，其次為黃酮類和鞣質(zhì)類成分.為了進(jìn)一步研究水楊梅化學(xué)成分的活性作用，本文首次對(duì)從水楊梅分離純化得到的化合物的抑菌活性和抗氧化活性進(jìn)行研究，并分析其構(gòu)效關(guān)系，期望從中獲得抑菌活性或抗氧化活性好的化合物，為進(jìn)一步開發(fā)利用水楊梅植物資源提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

從水楊梅中分離純化得到的β-谷甾醇、熊果酸、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和胡蘿卜苷[10]；從其它植物樣品中提取分離到的芹菜素、木犀草素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷[11].

1.1.2 供試菌種

細(xì)菌5株：大腸桿菌(Esherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、乳鏈球菌(Streptococcuslactis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis)；

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，瓊脂2.0 g，水100 mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.

1.2 儀器

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、YX280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、DH5000B電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、HZQ-Q全溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、DNM-9602A型酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備

將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸桿菌(E.c)、綠膿桿菌(P.a)、乳鏈球菌(S.l)金黃色葡萄球菌(S.a)、枯草芽孢桿菌(B.s)從恒溫培養(yǎng)箱中取出，在滅菌后的超凈工作臺(tái)上將以上各菌接種至配制好的液體培養(yǎng)基中，再將接菌后的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至全溫振蕩器，溫度恒定在28 ℃培養(yǎng)48 h，備用.

把高溫滅過菌的培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固，在無菌條件下，用接種環(huán)刮取少許的細(xì)菌接種到培養(yǎng)基上，再置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h.挑取少許的活化測(cè)試菌菌種放入5 mL無菌水中，搖勻，通過血球計(jì)數(shù)板配成含菌106CFU/mL的菌懸液.

1.3.2 試樣制備方法

將從水楊梅中分離純化得到的β-谷甾醇、熊果酸、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和胡蘿卜苷，分別稱取0.2 mg，用2 mL二甲基亞砜溶解，配制成濃度為0.1 mg/mL溶液，備用.

精確稱取山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，用乙醇分別配成質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的待測(cè)樣品1和質(zhì)量濃度為200μg/mL的待測(cè)樣品2.同時(shí)配制相同濃度的抗壞血酸和BHT乙醇溶液作為對(duì)照,備用.

DPPH溶液的配制 準(zhǔn)確稱取DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)0．020 0 g，無水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶，配成濃度為0.200 mg/mL的DPPH乙醇溶液，置于冰箱中冷藏備用.

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

(1)取紫外消毒的96孔板，豎排依次編號(hào)A、B、C、D、E、F、G、H、I，橫排依次編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11(編號(hào)為A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6、 A7、A8、A9、A10、A11，B1-B11……H1-H11，I1-I8).選取一種稀釋過的菌懸液，在滅菌的超凈工作臺(tái)上，將編好號(hào)的96孔板用移液槍全部注入150μL液體培養(yǎng)基.

(2)取配制好的待測(cè)β-谷甾醇樣品，用移液槍吸取150μL注入在已有菌懸液的A1孔中混勻.待菌懸液與β-谷甾醇樣品混勻后，再用移液槍從A1孔中吸取混合液體150μL，注入A2孔中混勻.再?gòu)腁2孔中吸取此混合液體150μL，注入A3孔中.重復(fù)上述操作過程，直到從A11孔中吸取出150μL混合溶液棄掉.A12孔則作為生長(zhǎng)對(duì)照.經(jīng)過此步操作A1-A11孔中β-谷甾醇樣品濃度則依次倍半稀釋.

(3)按照步驟(2)，將B1-B11注入熊果酸，C1-C11注入山奈酚，D1-D11注入槲皮素，E1-E11注入山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，F(xiàn)1-F11注入槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，G1-G11注入胡蘿卜苷.H1-H11為陽(yáng)性對(duì)照，革蘭氏陽(yáng)性菌注入青霉素鈉樣品溶液，革蘭氏陰性菌注入硫酸鏈霉素樣品溶液，I1-I11為空白對(duì)照.

(4)向所有板孔中加入10μL一種菌懸液.再取96孔板，按照步驟(1)～(3)把其它4種測(cè)試菌與各個(gè)待測(cè)樣品混合，完成后，將所有96孔板放入培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h.

(5)通過肉眼觀察，判定該化合物的最小抑菌濃度(MIC).

1.3.4 抗氧化活性測(cè)定(DPPH法)

參考文獻(xiàn)[12-14]的方法并稍加改變，采用倍半稀釋法制備不同濃度待測(cè)液.

(1)取96孔板，豎排依次編號(hào)A、B、C、D、E、F、G、H，橫排依次編號(hào)1-12.將編號(hào)的所有孔板用移液槍分別注入100μL無水乙醇.

(2)取配制好的山奈酚待測(cè)樣品1，用移液槍吸取100μL注入在已有100μL無水乙醇的A1孔中混勻.從A1孔中吸取混合液體100μL，注入到A2孔中混勻.重復(fù)上述操作，直到最后從A11孔中吸取出100μL混合溶液棄掉，A12孔做空白對(duì)照.待測(cè)樣品濃度A1-A11依次倍半稀釋.按同樣方法，將B1-B11也注入山奈酚待測(cè)樣品1.其余板孔可注入其它待測(cè)樣品(如C1-C11和D1-D11為山奈酚待測(cè)樣品2；E-H為槲皮素待測(cè)樣品1，2)，同時(shí)測(cè)定.

(3)用移液槍分別吸取100μL配制好的DPPH溶液，加入到A1-A12孔中；分別吸取100μL無水乙醇，加入到B1-B12孔中.室溫下避光35 min，在517 nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔的吸光度.

(4)平行測(cè)定3次，按公式計(jì)算DPPH自由基清除率(E).

其中，Aj表示100μL不同濃度樣品+100μL的DPPH溶液的吸光度；Ai表示100μL不同濃度樣品+100μL溶劑(無水乙醇)的吸光度；A0表示100μL的DPPH溶液+100μL溶劑(無水乙醇)的吸光度.

(5)以試樣濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖.選取清除率在20%～80%的點(diǎn)進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算清除率為50%時(shí)的濃度值，即IC50值.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的抑菌活性

水楊梅中分離得到的β-谷甾醇(Ⅰ)、熊果酸(Ⅱ)、山奈酚(Ⅲ)、槲皮素(Ⅳ)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅴ)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)和胡蘿卜苷(Ⅶ)的MIC測(cè)試結(jié)果見表1.山奈酚對(duì)所有測(cè)試菌均有不同程度的抑制活性，尤其是對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度達(dá)到7.8μg/mL；槲皮素對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.2μg/mL，對(duì)其它測(cè)試菌為125μg/mL；熊果酸、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)所有測(cè)試菌的活性均在250μg/mL左右；β-谷甾醇和胡蘿卜苷對(duì)綠膿桿菌的最小抑制濃度為250μg/mL，對(duì)其它測(cè)試菌則未顯示出抑制作用.結(jié)果表明山奈酚具有良好的抑菌作用.

表1 不同化合物對(duì)細(xì)菌最小抑菌濃度

注：Ⅷ-青霉素鈉，Ⅸ-硫酸鏈霉素,NA-未檢出.

2.2 化合物的抗氧化活性

通過DPPH法，按照1.3.4，測(cè)試不同化合物的抗氧化能力，結(jié)果見表2.

通過測(cè)定不同質(zhì)量濃度的山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷以及芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)DPPH自由基清除率，并計(jì)算得各化合物的IC50值.發(fā)現(xiàn)：這些黃酮類化合物的抗氧化能力由強(qiáng)到弱排序?yàn)殚纹に?槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷>山奈酚>木犀草素>木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷>山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷>芹菜素>芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷.

表2 各化合物抗氧化能力的IC50值

2.3 黃酮類化合物抗氧化能力的構(gòu)效關(guān)系

黃酮類化合物主要泛指2個(gè)苯環(huán)(A與B環(huán))通過中央三碳鏈相互連結(jié)而成的一系列化合物[15].對(duì)比各黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(見表3)可以發(fā)現(xiàn)有以下構(gòu)效關(guān)系：

(1)酚羥基多，活性強(qiáng)，五羥基黃酮槲皮素>四羥基黃酮山奈酚和木犀草素>三羥基黃酮芹菜素.

(2)黃酮醇大于黃酮.山奈酚、槲皮素優(yōu)于芹菜素和木犀草素，特別是同為四羥基的山奈酚要大于木犀草素.

(3)B環(huán)酚羥基活性高于A環(huán)，且鄰二酚羥基最為明顯.木犀草素糖苷為A環(huán)一個(gè)羥基，B環(huán)兩個(gè)羥基，其活性大于A環(huán)兩個(gè)羥基，B環(huán)一個(gè)羥基的山奈酚糖苷.

(4)苷元的活性大于糖苷，各個(gè)黃酮苷與其苷元均是如此.

表3 黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及IC50值

續(xù)表3

化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物IC50/(μg/ml)OH 57 HOOOR33'4'OHE R=OHF R=OGlc山奈酚E山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷F28.68358.25OH 57 HOOOR3OH 3'4'OHG R=OHH R=OGlc槲皮素G槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷H21.1628.62

3 結(jié)論

(1)水楊梅中含有豐富的具有生物活性的物質(zhì).分離純化得到的系列化合物(β-谷甾醇、熊果酸、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和胡蘿卜苷)對(duì)細(xì)菌均有不同的抗菌活性.相比之下，山奈酚的抑菌活性最好，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都具有較好的活性；槲皮素的活性較山奈酚相對(duì)弱些；黃酮苷和三萜類的熊果酸對(duì)所有測(cè)試菌的活性都不強(qiáng)；β-谷甾醇和胡蘿卜苷這類甾體化合物基本沒有抑菌活性.

(2)黃酮類化合物因結(jié)構(gòu)不同而具有不同的抗氧化能力.從水楊梅中分離得到的黃酮醇類化合物具有良好的抗氧化性，可以作為天然的抗氧化劑植物原料開發(fā)利用.

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