朱 超， 解井坤， 花 莉， 楊 冰, 沈 爍

(1.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 上海 200092)

0 引言

偶氮染料是一類由偶氮發(fā)色基團(tuán)(-N=N-)聯(lián)接的芳香類化合物，因其功能多樣而被廣泛地應(yīng)用于紡織、制革、塑料制造、印染、造紙、制藥和化妝品制造等產(chǎn)業(yè)[1,2].由于偶氮染料分子的高毒性和致癌性，其工業(yè)源排放對公共健康造成極大的威脅[3,4].

偶氮鍵的斷裂是偶氮染料分子細(xì)菌降解的前提，細(xì)菌通過偶氮還原酶來轉(zhuǎn)移電子攻擊偶氮鍵使其斷裂.雖然偶氮染料在有氧條件下不易被細(xì)菌所利用，但一些細(xì)菌種群能夠通過產(chǎn)生氧不敏感或好氧偶氮還原酶來進(jìn)行偶氮染料的脫色降解.部分細(xì)菌在厭氧和好氧條件下,均能進(jìn)行偶氮鍵的還原，從而產(chǎn)生有機(jī)胺類，這些胺類之后在各類氧化酶的催化下進(jìn)一步完成降解[5].

偶氮還原酶是偶氮染料降解菌表達(dá)的關(guān)鍵酶[6,7]，在染料污染區(qū)域的生物修復(fù)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[8].尤其是具備熱穩(wěn)定性的偶氮還原酶，由于可施用于高溫環(huán)境而具備極高的工業(yè)污水治理價值.Bacillusthuringiensis產(chǎn)偶氮還原酶(A0RCS1)是一類堿性熱穩(wěn)定偶氮還原酶，具有233個氨基酸殘基，分子量為61.6 KD，其活性最高耐受溫度可達(dá)80 ℃[9]，故其是研究偶氮還原酶酶熱穩(wěn)定性和蛋白結(jié)構(gòu)關(guān)系的理想對象.

目前,研究者對蛋白質(zhì)耐熱性機(jī)制存有不同的看法和見解，缺乏統(tǒng)一普遍的規(guī)律.已有研究顯示，與蛋白質(zhì)熱活性密切相關(guān)的因素有很多種，且往往是由這些因素共同作用的結(jié)果.其中，比較重要的影響因素有：氨基酸組成、二肽組成、氫鍵、鹽橋等[10].蛋白質(zhì)的氨基酸組成一直被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一.

為了進(jìn)一步了解此類偶氮還原酶的熱穩(wěn)定機(jī)制，以及研究如何提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，本研究基于蛋白質(zhì)序列特征和結(jié)構(gòu)特征分析了產(chǎn)自Bacillussp.的熱穩(wěn)定偶氮還原酶的特性，依據(jù)預(yù)測率確定了各種因素對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性影響的大小，并尋找了合適的蛋白質(zhì)耐熱性同結(jié)構(gòu)關(guān)系驗證的試驗方法.另外，通過偶氮還原酶變性和溫差脫色試驗驗證，進(jìn)一步探討了熱穩(wěn)定偶氮還原酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同其熱穩(wěn)定性的關(guān)系.本研究有利于人們深入理解蛋白質(zhì)的折疊、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，還有助于進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)工程等手段來改造獲得具有獨(dú)特生物學(xué)特性、更穩(wěn)定高效的熱穩(wěn)定偶氮還原酶類.

1 材料和方法

1.1 序列獲取和基礎(chǔ)分析

從UniProt數(shù)據(jù)庫獲得已測定氨基酸序列的偶氮還原酶登錄號等信息，根據(jù)產(chǎn)酶生物的不同對上述偶氮還原酶進(jìn)行篩選，保留產(chǎn)酶生物為Bacillus的偶氮還原酶氨基酸序列，再依據(jù)其是否為FMN依賴型熱穩(wěn)定性偶氮還原酶做進(jìn)一步篩選.

為了評估序列的一致性和保守性，本研究以偶氮還原酶STA(UniProt登錄號，A0RCS1)的氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn)，分別通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST軟件和ClustalX1.83對所得偶氮還原酶的氨基酸序列進(jìn)行局部比對和全局比對[11].之后，再進(jìn)一步使用TGREASE算法[12]分析偶氮還原酶STA的一級結(jié)構(gòu)，預(yù)測其理化性質(zhì).

1.2 STA二級結(jié)構(gòu)分析

通過TMHMM軟件，對偶氮還原酶STA進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，獲取相關(guān)的螺旋信息、跨膜區(qū)域等相關(guān)信息，為接下來的偶氮還原酶三級結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建與評價打下基礎(chǔ)[13,14].

1.3 STA三維模型構(gòu)建

本研究采用同源建模法[15-17]進(jìn)行STA三維蛋白模型的構(gòu)建,具體如下：

①獲取產(chǎn)自Bacillussp.的熱穩(wěn)定偶氮還原酶的堿基序列,以及編碼蛋白的氨基酸序列.

②通過PDB數(shù)據(jù)檢索獲取同產(chǎn)自Bacillussp.的熱穩(wěn)定偶氮還原酶序列一致性(≥40%)最高的已確定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，再將已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為產(chǎn)自Bacillussp.的熱穩(wěn)定偶氮還原酶的結(jié)構(gòu)模型模板，根據(jù)同源建模方法得到想要建立的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型.

③分別通過Pole Biolnformatique Lyonnais和SWISS-MODEL同源建模方法，構(gòu)建產(chǎn)自Bacillussp.的熱穩(wěn)定偶氮還原酶的三維結(jié)構(gòu)模型.

1.4 模型評價與特性分析

通過UCLA對上述構(gòu)建的兩個偶氮還原酶STA的空間模型進(jìn)行一系列分析，并將分析結(jié)果進(jìn)行比較，取各項指標(biāo)相對較好的模型作為偶氮還原酶STA的三維空間模型.通過PROCHECK程序[18,19],我們可以獲得偶氮還原酶STA模型的一系列立體化學(xué)參數(shù)，并且能以直觀的彩圖輸出部分結(jié)果.

該方法的原理主要是通過對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中高分辨的蛋白晶體結(jié)構(gòu)的參數(shù)進(jìn)行整理，以作為標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，再將輸入蛋白結(jié)構(gòu)所具有的參數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)進(jìn)行對比，如果兩者差異顯著，則說明輸入的蛋白結(jié)構(gòu)存在明顯問題.其輸出結(jié)果包括：Ramachandran圖、主鏈的鍵長與鍵角、二級結(jié)構(gòu)圖、平面?zhèn)孺溑c水平面之間的偏離程度等.

1.5 決定Bacillus sp.偶氮還原酶熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)因素分析

為了能夠結(jié)合上述結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，進(jìn)一步闡明決定Bacillussp.偶氮還原酶熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)因素，我們設(shè)計了下面的實驗進(jìn)行驗證：

①富集偶氮染料脫色菌株Bacillussp.T7，并進(jìn)行偶氮還原酶粗酶的提取[20].

②對粗提酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)針對性的變性.選用SDS(十二烷基磺酸鈉)(1 mmol/L)和甲醇(5%，V/V)等分別破壞酶蛋白的氫鍵和疏水相互作用.

考察30 ℃、40 ℃和50 ℃恒溫培養(yǎng)下添加了原酶和變性后酶對金橙溶液(12 mg/L)的脫色效果.經(jīng)48 h恒溫培養(yǎng)后，使用紫外-可見分光光度計對樣品進(jìn)行200～800 nm全波長掃描，并計算脫色率.對50 ℃下樣品進(jìn)行每1 h一次的跟蹤測定并記錄結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸序列分析

氨基酸殘基序列是決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，通過氨基酸序列比對可知不同蛋白氨基酸殘基序列的一致性和保守型.其中,一致性指兩個序列保守不變的區(qū)域；保守性指序列中某個位置的氨基酸發(fā)生了改變，但保留了原來殘基的物理化學(xué)性質(zhì).

搜索數(shù)據(jù)庫UniProt，得到偶氮還原酶STA的氨基酸序列.使用BLAST，以偶氮還原酶STA氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn)，分析了篩選的19種產(chǎn)自Bacillus的偶氮還原酶的一致性，其結(jié)果如表1所示.比對結(jié)果顯示，同STA相比較，多數(shù)偶氮還原酶序列相似性較低(21%～44%)，僅有STA-5與STA高度相似(99%).這說明即使是同屬微生物產(chǎn)生的偶氮還原酶也存在較大的差異，也說明了熱穩(wěn)定性偶氮還原酶氨基酸殘基的多態(tài)性.

表1 偶氮還原酶氨基酸序列一致性分析

使用ClustalX1.83對19種偶氮還原酶進(jìn)行保守型分析，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，即使存在氨基酸殘基的差異，但是不同Bacillus偶氮還原酶之間還是存在一定的保守性(不同顏色標(biāo)出).暗示氨基酸殘基的多樣性,并未影響偶氮還原酶結(jié)構(gòu)的保守型，以及由此決定的折疊后蛋白結(jié)構(gòu)和功能.

圖1 偶氮還原酶氨基酸序列保守型

2.2 STA一級結(jié)構(gòu)分析

使用TGREASE算法，我們對偶氮還原酶STA進(jìn)行了一級結(jié)構(gòu)分析，如圖2所示.結(jié)果顯示，偶氮還原酶STA的分子量約為25 907D，而C、H、N、O、S各元素含量分別為54.19%、7.00%、15.83%、21.99%、0.99%.STA由20種氨基酸組成，其中含量最高的為谷氨酸，含量為9.40%;其次為纈氨酸，含量為9.00%;含量最低的氨基酸是組氨酸，其含量為0.40%.

圖2 偶氮還原酶STA氨基酸組成

以氨基酸序列為橫坐標(biāo)，以各氨基酸親疏水性得分為縱坐標(biāo)，得到圖3.其中，以得分為0作為界線，得分越大疏水性越強(qiáng)，得分越小親水性越強(qiáng).比較0線以上曲線同0線圍成的面積和0線以下曲線同0線圍成的面積，我們可以得出:0線以下曲線同0線所圍成的面積大于0線以上曲線同0線圍成的面積.結(jié)合STA一級結(jié)構(gòu)中親水性氨基酸占全部殘基序列的比例大于疏水氨基酸所占整條氨基酸序列的比例，可知偶氮還原酶STA為親水性蛋白質(zhì)，其氫鍵作用強(qiáng).

圖3 偶氮還原酶STA親疏水性分析

2.3 STA二級結(jié)構(gòu)分析

本研究通過TMHMM軟件,對目標(biāo)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果如圖4所示.圖4中橫坐標(biāo)表示氨基酸殘基，縱坐標(biāo)為可信度.其中,紫色和藍(lán)色細(xì)線分別表示定位于膜外和膜內(nèi)的氨基酸殘基；紅色細(xì)線構(gòu)成的柱子表示屬于跨膜區(qū)的氨基酸殘基，柱子的高度越高可信度越高，一般柱高大于0.5才有參考價值，柱高小于0.5的，可信度差，一般忽略.本分析結(jié)果第一柱高約為0.8，為可信跨膜區(qū)，即從118到140的中間23個氨基酸對應(yīng)該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū).

圖4 偶氮還原酶STA跨膜區(qū)分析

使用EXPASY中TMPRED算法，對偶氮還原酶STA進(jìn)行螺旋分析，結(jié)果如圖5所示.圖5中橫坐標(biāo)表示氨基酸序列，縱坐標(biāo)表示在每個氨基酸殘基螺旋構(gòu)成判定的得分情況,實線表示氨基酸內(nèi)-外螺旋評價的得分，虛線表示氨基酸外-內(nèi)螺旋評價的得分.當(dāng)?shù)梅譃樨?fù)數(shù)時，表明此處對應(yīng)的氨基酸殘基不屬于該蛋白質(zhì)跨膜區(qū);當(dāng)?shù)梅譃檎龝r，表示此處對應(yīng)的氨基酸殘基屬于該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū);當(dāng)?shù)梅执笥?00時，可信度較高，一般認(rèn)為一定有螺旋結(jié)構(gòu)存在.

由圖5可知，偶氮還原酶STA氨基酸具有兩個螺旋結(jié)構(gòu).在118到139處，內(nèi)-外螺旋評價得分為1278，外-內(nèi)螺旋評價得分為1 374，所以該部分氨基酸屬于外-內(nèi)螺旋結(jié)構(gòu)；在183到205處,內(nèi)-外螺旋評價得分為906，外-內(nèi)螺旋評價得分為618，所以該部分氨基酸屬于內(nèi)-外螺旋結(jié)構(gòu).綜合可知，偶氮還原酶STA的跨膜螺旋區(qū)在第118到139個氨基酸部分，且該部分屬于外-內(nèi)螺旋結(jié)構(gòu).

圖5 偶氮還原酶STA的螺旋結(jié)構(gòu)分析

2.4 STA三維結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建與評價

本文使用3P0R 作為模板，通過Pole Biolnformatique Lyonnais和SWISS MODEL等兩種方法，進(jìn)行偶氮還原酶STA三維模型的構(gòu)建工作.經(jīng)模型評價后，得出SWISS MODEL法構(gòu)建的三維模型更為可信，此處只展示基于SWISS MODEL法的STA三維模型和評分結(jié)果.

圖6為偶氮還原酶STA的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖.其中,圖6(a)和圖6(b)為不同角度展示的蛋白雙體圖,圖6(c)為結(jié)合了氨基酸殘基鍵角鍵長的蛋白雙體理論圖，圖6(d)為STA蛋白單體展示圖.

可以得知，偶氮還原酶STA單體呈α/β結(jié)構(gòu)，分子中含有五個α-螺旋，五個β-折疊，螺旋與折疊交替出現(xiàn).五個β-折疊相互平行，形成一個平面，位于分子的中間；α-螺旋分列于平面的兩側(cè)，一側(cè)兩個，另一側(cè)三個.

a b

c d圖6 基于SWISS MODEL構(gòu)建的 STA蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型

表征蛋白質(zhì)主鏈二面角允許值范圍的圖形稱為Ramachandran圖(圈中紅色、黃色及灰色分別代表氨基酸殘基一面角分布的最適區(qū)、額外允許區(qū)及一般允許區(qū))，其在生物信息學(xué)中常用來驗證結(jié)構(gòu)模型的可靠性.

如圖7可知，模型中所有氨基酸殘基均分布在允許的范圍內(nèi)，無不允許殘基位置出現(xiàn).位于最適區(qū)的殘基(A，B，L)共333個，占總殘基數(shù)的92.0%，位于額外允許區(qū)的殘基(a, b,l,p)共26個，占總殘基數(shù)的7.2%，位于一般允許區(qū)域的殘基(-a,-b,-l,-p)共3個，占?xì)埢鶖?shù)的0.8%，沒有殘基位于不允許區(qū)域.總殘基數(shù)為416個，其中,含有非甘氨酸和非脯氨酸殘基362個，末端殘基(Gly和Pro除外)4個，甘氨酸殘基(以▲表示)30個，脯氨酸殘基20個.這表明該模型中蛋白質(zhì)主鏈殘基的二面角的構(gòu)象合理，上述數(shù)據(jù)亦表明模型較為合理，能夠反映該酶的結(jié)構(gòu)信息.

圖7 基于SWISS MODEL構(gòu)建的STA 蛋白質(zhì)三維模型的Ramachandran評價圖

2.5 STA的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等密切相關(guān)，通常的影響因素有疏水相互作用、二硫鍵作用、氫鍵作用和離子鍵作用等.已有研究表明[21]，疏水作用對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性貢獻(xiàn)在60%左右，而氫鍵對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性貢獻(xiàn)在40%左右.

根據(jù)STA的氨基酸序列分析結(jié)果，STA不含有半胱氨酸，即不會有二硫鍵形成.因此，影響該蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的主要因素是疏水相互作用和氫鍵作用.在水介質(zhì)中，球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，這一現(xiàn)象被稱為疏水相互作用.通過對偶氮還原酶STA二級結(jié)構(gòu)分析和三維空間結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建，可以得到，偶氮還原酶STA是一種呈α/β三明治結(jié)構(gòu)的球狀蛋白質(zhì).由于其所擁有的球狀結(jié)構(gòu)使得該蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)緊緊地包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部，親水基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)外層.因此，偶氮還原酶STA的熱穩(wěn)定性主要是因為其強(qiáng)烈的氫鍵作用，以及較強(qiáng)的疏水相互作用所引起的.

2.6 偶氮還原酶變性后脫色試驗分析

為驗證基于生物信息學(xué)分析對STA熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系的推論，我們進(jìn)行了產(chǎn)自Bacillussp. 的偶氮還原酶粗酶的提取，并進(jìn)行了選擇性變性和隨后的脫色活性測試.

圖8反映的是50 ℃下添加不同變性酶的甲基橙溶液隨時間的脫色率變化.由圖8可知,隨時間的推移,各處理脫色率均有所增加.其中,添加粗酶提取物的試樣脫色率最好，厭氧和好氧馴化所得酶的最終脫色率分別為43.8%和47.0%;添加SDS變性酶的試樣脫色率最低，厭氧和好氧試樣最終脫色率分別為10.9%和10.2%;添加甲醇變性后酶的試樣脫色率介于前兩者之間，厭氧和好氧試樣最終脫色率分別為37.6%和35.1%.

圖8 50 ℃下不同變性酶 對甲基橙溶液的脫色率

圖9反映的是在不同溫度下添加不同變性后酶的處理對甲基橙溶液的脫色能力.在48 h反應(yīng)期內(nèi)，隨著溫度升高，各處理脫色率均有所增加.其中,添加粗酶提取物的試樣脫色率變化最大，添加甲醇變性酶的試樣脫色率變化較前者低，添加SDS變性酶的試樣脫色率變化不大.50 ℃下，添加粗酶提取物的甲基橙溶液脫色率最高，厭氧和好氧試樣最終脫色率分別為78.14%和77.13%；添加SDS變性酶的甲基橙溶液脫色率最差，厭氧和好氧試樣最終脫色率分別為61.6%和78.14%；添加甲醇變性酶的脫色率介于前兩者之間，厭氧和好氧試樣最終脫色率分別為73.9%和72.78%.

圖9 不同溫度下不同變性酶 對甲基橙溶液的脫色率

由于SDS是通過作用于蛋白質(zhì)的氫鍵來破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，甲醇是通過影響蛋白質(zhì)的疏水相互作用來影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，因此，可以得知,影響偶氮還原酶STA熱穩(wěn)定性的主要因素為其強(qiáng)烈的氫鍵作用和較強(qiáng)的疏水相互作用.這一點同偶氮還原酶STA的生物信息學(xué)分析結(jié)果是一致的.

3 結(jié)論

本研究在分析了產(chǎn)自Bacillussp.的熱穩(wěn)定偶氮還原酶STA的生物信息學(xué)基礎(chǔ)上，通過向偶氮染料溶液中添加不同的變性酶，探討了影響偶氮還原酶STA熱穩(wěn)定性的因素.主要結(jié)論為：

偶氮還原酶STA是一種不含有二硫鍵的親水性蛋白質(zhì)；STA在第118到139個氨基酸處存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，為內(nèi)-外螺旋；基于SWISS MODEL構(gòu)建的模型顯示,STA的單體具有類似黃素氧化還原蛋白的α/β型結(jié)構(gòu)；影響偶氮還原酶STA熱穩(wěn)定性的主要因素是蛋白質(zhì)的疏水相互作用和氫鍵作用.

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