賀小賢， 鄭茂奎， 劉 歡， 彭光杰

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

乳鏈菌肽(Nisin)是一種由乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)生的具有很強(qiáng)殺菌作用的細(xì)菌素,是食品和藥物管理局(FAD)和世界衛(wèi)生組織(WTO)允許商業(yè)化生產(chǎn)的食品添加劑[1].它能夠有效抑制大部分革蘭氏陽性細(xì)菌(G+)以及芽孢桿菌的孢子的繁殖，特別對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌的作用明顯[2].目前，乳鏈菌肽廣泛用于罐裝食品、植物蛋白食品、酒精飲料、乳制品和肉制品等的保藏中[3].

乳鏈球菌發(fā)酵Nisin的能力，除了受菌株自身特性的影響，還受到發(fā)酵條件的影響，如發(fā)酵溫度[4]、攪拌速率、接種量[5]等.為了提高乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的能力，國內(nèi)外許多研究者對發(fā)酵法生產(chǎn)Nisin進(jìn)行了研究.

趙春燕[6]等研究乳酸鏈球菌菌株(Lactococculactissubsp.lactics) W4生產(chǎn)乳鏈菌肽的條件以及影響因素，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究碳源、氮源、磷酸鹽、金屬離子和發(fā)酵條件，結(jié)果認(rèn)為葡萄糖是W4菌株發(fā)酵的最佳碳源，酵母膏為最佳氮源，K2HPO4、Fe2+、Mg2+對其發(fā)酵有促進(jìn)作用，而Cu2+有強(qiáng)抑制作用.初始pH6.5、2%接種量、35 ℃下振蕩培養(yǎng)有利于W4菌株生長和Nisin的產(chǎn)生.

白澤樸[7]等研究了乳酸乳球菌乳酸亞種T0625菌株生產(chǎn)Nisin的最佳培養(yǎng)條件，即裝液量250 mL、接種量7 %、起始pH 6.5、培養(yǎng)溫度35 ℃，Nisin的抑菌活性達(dá)到最大.

Saeed Mirdamadi[8]等通過正交試驗(yàn)對乳酸鏈球菌菌株(Lactococcuslactissubsp.lactis)ATCC 11454發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在裝液量75 mL/250 mL、初始pH8、接種量為1%、攪拌速率100 r/min、接種齡24 h、溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間32 h，Nisin的最大活性為606 IU/mL.

諸多優(yōu)化主要采用正交試驗(yàn)法，而采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳鏈菌肽發(fā)酵條件和加工工藝參數(shù)報(bào)道較少.為了獲得嗜熱乳鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的工藝條件，提高效價(jià)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析發(fā)酵初始pH、接種量和玉米漿添加量對Nisin發(fā)酵的影響，并對參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終得到二次回歸方程并確定最佳的發(fā)酵參數(shù)，為Nisin的發(fā)酵研究提供一定的參考.

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 菌株

Nisin發(fā)酵菌株:嗜熱乳鏈球菌6032(Streptococcus Thermophilus)，本研究室保藏菌種；效價(jià)檢測菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，本研究室保藏菌種.

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)菌種活化培養(yǎng)基：脫脂乳培養(yǎng)基，105 ℃～108 ℃滅菌20 min.

(2)種子培養(yǎng)基：CM[9]培養(yǎng)基.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，硫酸鎂0.58，磷酸氫二鉀2.0，檸檬酸二銨2.0，乙酸鈉5.0，硫酸錳0.25，吐溫80 2.0 mL，pH6.5，玉米漿按照體積比添加，121 ℃，滅菌20 min.

(4)效價(jià)檢測培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨8.0，葡萄糖5.0，酵母浸粉2.5，磷酸氫二鈉2.0， 氯化鈉5.0，瓊脂粉10.0，pH7.2～7.4，121 ℃，滅菌20 min.

1.1.3 試劑

Nisin標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司.

玉米漿，干物質(zhì)≥50.0%，pH值3.5～4.0，來自陜西寶雞阜豐生物科技有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

脫脂乳培養(yǎng)基活化乳酸鏈球菌，活化3次備用.

1.2.2 種子培養(yǎng)

活化菌種接入種子培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)18 h，菌體濃度6.7×109CFU/mL.

1.2.3 分批發(fā)酵

將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5.0%，30 ℃靜止培養(yǎng)20 h，發(fā)酵液pH調(diào)至2.5，5 400 r/min離心12 min[10]，收集上清液測定發(fā)酵液效價(jià).

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以初始pH、接種量、玉米漿添加量、發(fā)酵溫度、進(jìn)行單次單因素實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)3次取其平均值，分析各單因素對Nisin發(fā)酵效價(jià)的影響.

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化Nisin的發(fā)酵參數(shù)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過Box-Behnken模型以玉米漿添加量(A)、接種量(B)、初始pH(C)為自變量，以Nisin的效價(jià)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，擬合自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系.每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)水平及編碼

1.2.6 測定方法

效價(jià)測定方法:瓊脂擴(kuò)散法[11]；OD600值的測定：分光光度法測定；pH值的測定：pB-10精密pH計(jì)測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜熱乳鏈球菌6032發(fā)酵曲線

由圖1可知，菌體生長經(jīng)歷停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期，菌體在生長18 h后達(dá)到最大.嗜熱乳鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的過程中，Nisin的產(chǎn)生與生物量的合成幾乎同步進(jìn)行.當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，Nisin的合成也隨之停止，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的乳酸，過低的pH影響乳鏈球菌菌體的生長，從而抑制了Nisin的合成.進(jìn)入穩(wěn)定期的效價(jià)維持一段時(shí)間后開始有下降的趨勢，因此,確定合適的發(fā)酵時(shí)間十分重要,可選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為20 h.

圖1 嗜熱乳鏈球菌6032生長 曲線、pH、效價(jià)變化曲線

2.2 不同單因素對Nisin效價(jià)的影響

2.2.1 接種量對Nisin效價(jià)的影響

接種量的大小影響細(xì)胞的生長和代謝產(chǎn)物的合成，接種量小，使發(fā)酵菌株的延遲期增長，不利于產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累，發(fā)酵周期長；接種量過高反而使菌體生長過快，積累過多的代謝產(chǎn)物，抑制后期菌體的生長.為了確定最適的接種量，設(shè)計(jì)不同接種量發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同接種量對Nisin效價(jià)的影響

由圖2可知，當(dāng)接種量較小時(shí)，Nisin的效價(jià)很低，可能是嗜熱乳酸鏈球菌沒能達(dá)到菌體的最大密度，從而影響Nisin的產(chǎn)生和累積，當(dāng)接種量過大時(shí)，細(xì)胞之間競爭性的消耗底物，影響Nisin的合成.當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為5%時(shí),Nisin的效價(jià)達(dá)到最大，為902.48 IU/mL.

2.2.2 不同初始pH對Nisin效價(jià)的影響

發(fā)酵環(huán)境的pH對微生物生長和產(chǎn)物合成具有明顯的影響，pH的改變影響細(xì)胞膜的通透性，影響細(xì)胞代謝活動(dòng)中的酶的活性，從而影響產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累.為了確定最適的初始pH，設(shè)計(jì)不同pH的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同初始pH對Nisin效價(jià)的影響

由圖3可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的不同初始pH對Nisin效價(jià)的影響比較明顯，pH過高或者過低都影響乳鏈球菌的生長和Nisin的累積，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為7時(shí)，Nisin的效價(jià)達(dá)到最高，為875.79 IU/mL.嗜熱乳酸鏈球菌為細(xì)菌，其最適生長pH為6.5～7.0，而的Nisin合成和細(xì)胞的生長同步進(jìn)行，因此在pH為7時(shí)，Nisin的效價(jià)最大.

2.2.3 不同玉米漿添加量對Nisin效價(jià)的影響

玉米漿富含維生素、生物素、嘌呤、嘧啶等微量有機(jī)質(zhì)[12]對菌體的生長會(huì)有促進(jìn)作用，從而提高了乳鏈菌肽的效價(jià).選玉米漿作為Nisin發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分之一, 對玉米漿的最佳添加量進(jìn)行考察.

圖4 玉米漿濃度對Nisin效價(jià)的影響

由圖4可知，隨著玉米漿添加量的增加，Nisin的效價(jià)先是增大后減少，當(dāng)玉米漿添加量為25%時(shí)，Nisin的效價(jià)達(dá)到最大為1 357.46 IU/mL.可能是因?yàn)橛衩诐{的質(zhì)量濃度提高時(shí),體系營養(yǎng)成分增加,有利于菌體生長繁殖,使得發(fā)酵液中Nisin的效價(jià)增加.但加入的營養(yǎng)過多,嗜熱如鏈球菌生長過快，加速了細(xì)菌的衰老，反而抑制了菌體的正常生長從而使Nisin的活性下降.因此選取玉米漿的最佳添加量為25%.

2.2.4 不同培養(yǎng)溫度對Nisin效價(jià)的影響

溫度影響細(xì)菌細(xì)胞的生長和代謝產(chǎn)物的積累，是發(fā)酵過程中的重要影響因素.細(xì)菌的最適培養(yǎng)溫度不一定是最適發(fā)酵溫度，為了研究最適發(fā)酵溫度，設(shè)計(jì)不同溫度梯度，考察不同溫度對Nisin效價(jià)的影響.

圖5 培養(yǎng)溫度對Nisin效價(jià)的影響

由圖5可知，培養(yǎng)溫度過高過低時(shí)，Nisin的效價(jià)比較低，可能是因?yàn)闇囟冗^低時(shí)不適于細(xì)胞的生長，從而影響代謝產(chǎn)物的積累.培養(yǎng)溫度過高時(shí)，細(xì)胞生長繁殖加快，酶的活性加快，使細(xì)胞衰老提前，發(fā)酵周期縮短，也不利于產(chǎn)物的積累.培養(yǎng)溫度在30 ℃～34 ℃范圍內(nèi)，對Nisin的效價(jià)沒有影響，響應(yīng)面設(shè)計(jì)不考慮溫度的影響，選擇30 ℃作為最佳的培養(yǎng)溫度.

2.3 響應(yīng)面模型的建立以及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定Nisin的最佳發(fā)酵參數(shù).通過Box-Behnken模型[13,14]分析發(fā)酵初始pH、接種量、玉米漿添加量對Nisin效價(jià)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

表2 Nisin發(fā)酵條件的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert7.0軟件對表 2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，二次多項(xiàng)式回歸模型方程Y=1 528.22+193.38A-32.46B-100.42C-86.37AB-49.55AC+167.56BC-696.46A2-216.39B2-190.13C2.

對上述回歸模型進(jìn)行方差分析如表3所示.結(jié)果表明：模型是F值30.24，P<0.000 1，說明該模型是極顯著的，該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，可以用于Nisin發(fā)酵生產(chǎn)的理論預(yù)測.回歸模型的RAdj=0.942 7，能夠解釋97.49% 的變化，擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小.方程一次項(xiàng)的影響中A和C的P<0.01，差異極顯著，B的P>0.05，差異不顯著；二次項(xiàng)的影響中A2、B2、C2的P<0.01，差異極顯著；AB、AC的交互作用P>0.05，交互差異不顯著，BC的交互作用P<0.01差異極顯著.

通過回歸系數(shù)絕對值大小分析各個(gè)因素的改變對嗜熱乳鏈球菌6032 發(fā)酵產(chǎn)Nisin影響程度.3個(gè)因素對該菌代謝產(chǎn)Nisin的影響大小依次為：玉米漿濃度添加量>發(fā)酵pH>接種量.

表3 回歸方程系數(shù)顯著性分析表

注：P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著.

利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到的二次回歸方程的響應(yīng)面和等高線.

(a)A和B的交互效應(yīng)

(b)A和C的交互效應(yīng)

(c)B與C的交互效應(yīng)圖6 各因素交互效應(yīng)對Nisin效價(jià)影響 的響應(yīng)曲面及等高線圖

經(jīng)Design Expert軟件處理，得到的響應(yīng)面曲面及等高線圖如圖5所示，響應(yīng)面的形狀可反應(yīng)出單因素對Nisin效價(jià)的影響.由圖5(a)可以看出，兩個(gè)因素的交互不顯著，由等高線圖可知，玉米漿添加量對Nisin的影響比初始pH影響顯著，因?yàn)檠赜衩诐{添加量軸向等高線相對密集.由圖5(b)可見，兩個(gè)因素的交互不顯著.由圖5(c)可以看出，兩個(gè)交互項(xiàng)顯著，接種量不變，隨著pH變小，Nisin的效價(jià)增大.當(dāng)接種量4%～5%，pH5～6時(shí)，Nisin的效價(jià)達(dá)到最大，可能是因?yàn)榫w生長的最適pH值不一定是Nisin合成的最佳pH值[15].大多數(shù)認(rèn)為pH應(yīng)在5.8～6.0之間生產(chǎn)Nisin是合適的，這通常低于最佳生長pH.

通過回歸模型，采用Design-Expert 7.0軟件優(yōu)化乳鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)Nisin發(fā)酵參數(shù)，當(dāng)初始pH6.60，接種量4.79%，玉米漿濃度25.61%，Nisin的效價(jià)可達(dá)到1 581.01 IU/mL.考慮到實(shí)際操作的便利，將發(fā)酵條件修正為初始pH6.60、接種量4.80%、玉米漿添加量25.60%.采用修正后的條件參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得的Nisin效價(jià)為1 602.77 IU/mL，實(shí)驗(yàn)相對誤差小.發(fā)酵條件優(yōu)化前，Nisin的效價(jià)為1 357.41 IU/mL,優(yōu)化后Nisin的效價(jià)達(dá)到了1 602.77 IU/mL，Nisin的效價(jià)提高了18.07%.

3 結(jié)論

(1)嗜熱乳鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)Nisin，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在接種量為5.0%、初始pH為7.0、玉米漿的添加量為25.0%、培養(yǎng)溫度30 ℃條件下，Nisin的效價(jià)為1 357.46 IU/mL.

(2)利用Design-Expert7.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面對Nisin發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了Nisin效價(jià)與初始pH、接種量、玉米漿添加量3個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸模型，回歸分析表明，玉米漿添加量(A)、初始pH(C)對響應(yīng)值均有極顯著影響，且與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該模型合理可靠.

(3)玉米漿濃度對影響Nisin效價(jià)影響最大，而接種量影響最小，初始pH與玉米漿添加量交互效應(yīng)為顯著.

(4)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵條件為初始pH6.60、接種量4.80%、玉米漿添加量25.60%.在此條件下效價(jià)為1 602.77±6.38 IU/mL，較優(yōu)化前提高了18.07%.

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