呂嘉櫪， 鄭欣欣, 馬亞寧

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.商丘出入境檢驗檢疫局， 河南 商丘 476100)

0 引言

冠突散囊菌(Eurotiumcristutum)是茯磚茶“發(fā)花”過程中的優(yōu)勢菌[1-3]，冠突散囊菌閉囊殼呈金黃色，俗稱“金花”菌.楊撫林[4]對冠突散囊菌黑茶發(fā)酵液進(jìn)行了酶學(xué)研究，表明冠突散囊菌黑茶發(fā)酵液對α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力都有很好的促進(jìn)作用，對脂肪酶有較強(qiáng)的抑制.傅冬和等[5]對茯磚茶的不同萃取物對消化酶活性的影響作了研究，表明不同萃取物對α-淀粉酶均有促進(jìn)作用.傅冬和等[6-8]運用高通量篩選技術(shù)對茯磚茶不同萃取部分和茯磚茶中幾種單體成分的降脂減肥等活性進(jìn)行了研究，證明茯磚茶有多條降脂途徑且降脂減肥能力較強(qiáng).袁勇[9]采用現(xiàn)代分析技術(shù)對茯茶中“金花”菌進(jìn)行了提取分離，表明提取物具有降脂效果，謝春生[10，11]研究了云南普洱茶中有效降血脂成分，表明洛伐他汀是普洱熟茶中特有的降血脂成分.

鄧放明[12]用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)冠突散囊菌，對其有關(guān)生化成分的動態(tài)變化進(jìn)行了研究，龔淑俐等[13]從茯磚茶中分離純化出冠突散囊菌并進(jìn)行液體深層發(fā)酵.目前對金花菌的代謝物質(zhì)研究主要集中在多糖、茶多酚等，而對金花菌產(chǎn)生的降脂類物質(zhì)處于初步研究.

本文通過對金花菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，用乙酸乙酯輔助超聲波提取發(fā)酵物中的降脂類物質(zhì)，通過薄層色譜法、高效液相色譜法對發(fā)酵物中是否存在降脂類物質(zhì)進(jìn)行驗證.

1 材料與方法

1.1 菌種

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)：由陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物教研室提供.

1.2 材料

1.2.1 主要設(shè)備與試劑

(1)設(shè)備：HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子有限公司)，KH-100B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000B(上海亞榮生化儀器廠)，HC-高速冷凍離心機(jī)(3018R安微中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，10×5 cm硅膠薄層板(上海鑫楚實業(yè))，干燥器(山東天力干燥股份有限公司)，HPLC高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司).

(2)試劑：乙酸乙酯、甲醇、氯仿、氨水、等，均為分析純；甲醇(色譜純).

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基：蔗糖4.0 g、K2HPO40.1 g、NH4NO30.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、瓊脂2.0 g、水100 mL，121 ℃滅菌20 min.

(2)液體培養(yǎng)基：蔗糖6%、大豆粉2.5%、K2HPO40.2%、121 ℃滅菌20 min.

1.3 方法

1.3.1 金花菌的活化培養(yǎng)

將保藏于冰箱中的金花菌菌種于28 ℃、CZG平板培養(yǎng)基上活化5 d，挑選顏色黃亮并且無雜菌污染的平板，以備液體培養(yǎng)的菌懸液用.

1.3.2 金花菌的液體培養(yǎng)

將活化后的金花菌用無菌水制備成孢子菌懸液，孢子數(shù)在106～107個/mL，按照10%接種量向液體培養(yǎng)基中接種，在培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 rad/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每隔24 h觀察金花菌生長情況，并進(jìn)行提取分離測定.

1.3.3 洛伐他汀對照品溶液的制備

洛伐他汀對照品溶液的制備[14]：精密稱取2 mg的洛伐他汀，定容于10 mL的甲醇溶液中，配制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.3.4 樣品溶液的制備

取一定體積培養(yǎng)完全的金花菌液體發(fā)酵物，按照1∶4的體積比加入乙酸乙酯，輔助超聲波處理2 h進(jìn)行提取，再用分液漏斗去除混合液中的水相，將有機(jī)相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后用5 mL甲醇溶解濃縮物，再用0.45μL的有機(jī)濾膜過濾后制成待檢樣品.

1.3.5 洛伐他汀的TLC分析

稱取GF254硅膠適量于研缽中，按1∶3加入0.5%的CMC-Na溶液，去除表面氣泡，制成薄層板，于105 ℃活化1 h，置于干燥器中備用.

用毛細(xì)管分別對樣品和對照品在層析板上點樣，展開劑為(氯仿∶甲醇∶氨水=25∶3∶1)，展開后放入含有適量碘晶體的顯色缸中，顯色后測量各條帶的Rf值.

1.3.6 洛伐他汀的檢測

HPLC檢測條件[15]為：柱型：C18柱；流動相：甲醇∶水=80∶20；檢測波長：238 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 洛伐他汀的TLC分析結(jié)果

(由左至右依次為：a為洛伐他汀對照品溶液,b、c、d為金花菌液體培養(yǎng)提取液)圖1 金花菌液體培養(yǎng)提取液薄層圖

由圖1可知：在展開劑為(氯仿∶甲醇∶氨水=25∶3∶1)條件下薄層板經(jīng)碘蒸氣顯色后，洛伐他汀對照品在距起始點5.1 cm處有明顯的黃色斑點出現(xiàn)，金花菌的液體培養(yǎng)提取液的三個條帶經(jīng)顯色后出現(xiàn)多個分離完全的斑點，并且在與洛伐他汀對照品對應(yīng)的5.1 cm處也有相同的黃色斑點.對薄層斑點測量后洛伐他汀對照品的比移值Rf為0.544，金花菌液體培養(yǎng)提取液的三個斑點的Rf分別為：0.554、0.554、0.565，斑點Rf值在0.2～0.8范圍內(nèi)，展開效果優(yōu)良.因此，通過薄層層析結(jié)果可以初步確定金花菌液體發(fā)酵提取液中含有降脂類物質(zhì)——洛伐他汀.

2.2 洛伐他汀HPLC檢測結(jié)果

2.2.1 TLC分離樣品檢測

在上述色譜條件下，收集薄層結(jié)果中與對照品同一位置處的黃色斑點樣品，再用甲醇溶解10 min后離心，收集上清液后再用0.45μL的有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行HPLC.結(jié)果如圖2、圖3所示.

圖2 洛伐他汀對照品高效液相色譜圖

圖3 金花菌液體發(fā)酵提取液高效液相色譜圖

圖2為洛伐他汀對照品色譜圖，其出現(xiàn)兩個顯著的色譜峰，保留時間分別為12.321 min和14.853 min，保留時間在12.321 min為檢測峰，圖3為TLC結(jié)果中與洛伐他汀對應(yīng)斑點色譜圖，其色譜圖在12.296 min和14.493 min處出現(xiàn)明顯的色譜峰.通過對比圖2與圖3的保留時間，發(fā)現(xiàn)樣品與對照品的兩個相對應(yīng)的色譜峰的保留時間差為0.025和0.360，且第一組色譜峰對應(yīng)關(guān)系極其顯著.因此，通過HPLC圖譜和TLC結(jié)果相結(jié)合可以確定金花菌液體發(fā)酵提取液中含有降脂類物質(zhì)——洛伐他汀.

2.2.2 不同發(fā)酵時間樣品檢測

在色譜條件下，對不同發(fā)酵時間的金花菌液體發(fā)酵物提取后進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4～圖9所示.

圖4 洛伐他汀對照品高效液相色譜圖

圖5 金花菌液體發(fā)酵2 d高效液相色譜圖

圖6 金花菌液體發(fā)酵3 d高效液相色譜圖

圖7 金花菌液體發(fā)酵4 d高效液相色譜圖

圖8 金花菌液體發(fā)酵5 d高效液相色譜圖

圖9 金花菌液體發(fā)酵提取液加洛伐他汀 對照品高效液相色譜圖

圖4為洛伐他汀對照品的色譜圖，其保留時間為17.293 min，圖5～圖8分別為金花菌液體發(fā)酵不同時間提取液色譜圖，色譜圖表明在發(fā)酵2 d時沒有出現(xiàn)與對照品對應(yīng)的色譜峰，第3 d、4 d、5 d出現(xiàn)與對照品對應(yīng)的色譜峰.并且第4 d的色譜峰最為理想.圖7為發(fā)酵4 d時樣品在17.523處出現(xiàn)與對照品對應(yīng)的色譜峰，兩者的保留時間差為0.230 min，可以推斷樣品中含有洛伐他汀.為了再次確定樣品與對照品的色譜峰為同一物質(zhì)的色譜峰，將少量的對照品溶液加入樣品溶液中混勻后再次進(jìn)行色譜分析.圖9為發(fā)酵4 d樣品加入對照品后色譜圖，其保留時間為17.461 min，與對照品和第4 d樣品相對應(yīng)的色譜峰保留時間差為0.062 min和0.178 min，因此可以確定對照品、樣品和樣品加對照品的三個峰為同一物質(zhì)的色譜峰，表明樣品中含有洛伐他汀.

3 結(jié)論

通過對冠突散囊菌液體發(fā)酵產(chǎn)降脂類物質(zhì)的研究，根據(jù)薄層色譜法和高效液相色譜法分析結(jié)果，證明冠突散囊菌液體發(fā)酵提取液中含有降脂成分洛伐他汀，并且在HPLC色譜圖中對照品和樣品都出現(xiàn)兩個對應(yīng)的色譜峰，說明對照品和樣品中都存在酸式洛伐他汀和酯式洛伐他汀.

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