龐坤，肖世文（等）

摘要：從奶牛組織中克隆Tenomodulin（TNMD）基因的cDNA序列，采用雙酶切后連接表達(dá)載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，TNMD基因的序列全長為957 bp，通過雙酶切構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-TNMD在BL21大腸桿菌中成功表達(dá)了分子量為59.68 kDa的融合蛋白。

關(guān)鍵詞：奶牛；Tenomodulin（TNMD）；克??；原核表達(dá)

中圖分類號：S823；S961.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1681-03

Cloning and Prokaryotic Expression of Bovine TNMD Gene

PANG Kun1，XIAO Shi-wen1，CHEN Hong-zhi1，YI Ben-chi1，LIU Ji-cheng1，HAN Li-qiang2

（1.Animal Scientific Department， Xinyang College of Agricultural and Forestry， Xinyang 464000， Henan， China；

2.College of Animal Husbandry and Veterinary Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002，China）

Abstract： The Tenomodulin（TNMD） cDNA of bovine was amplified by RT-CR. Then the gene fragment was digested with enzyme and cloned into expression vector pGEX-4T-1. The recombinant vector was transformed into E. coli BL21. The results showed that the full-length of the TNMD gene sequence was 957 bp. The reconstruction plasmid pGEX-TNMD was constructed successfully and a 59.68 kDa fusion protein was expressed in E. coli BL21 induced by IPTG.

Key words： bovine；Tenomodulin（TNMD）； cloning； prokaryotic expression

隨著基因組學(xué)和高通量測序的發(fā)展，奶牛等家畜的基因組序列逐漸明確，所發(fā)現(xiàn)的基因數(shù)目也越來越多，但對于其中許多新基因的功能尚不清楚。Tenomodulin（TNMD）屬于跨膜蛋白中家族成員，這一家族主要成員與蛋白錯誤折疊引起的慢性疾病有關(guān)，在人和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，TNMD是一種血管生成抑制因子，在一些血液流動少的組織，如肌腱和軟骨組織中大量的表達(dá)[1，2]，在芯片研究中發(fā)現(xiàn)TNMD表達(dá)在人的脂肪組織中，并且與動物機(jī)體的體重減輕和胰島素的敏感性有關(guān)[3，4]，其他研究發(fā)現(xiàn)TNMD基因的單核苷酸位點(diǎn)變異與機(jī)體的肥胖[5]、系統(tǒng)免疫[6]和膽固醇水平[7]也有一定的關(guān)聯(lián)。這些研究都集中在小鼠等模式動物，對于奶牛的TNMD蛋白的生物學(xué)功能來說，目前了解的還不太清楚。因此本試驗(yàn)通過克隆表達(dá)奶牛的TNMD蛋白，為其功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛組織采自鄭州市弓馬莊屠宰場屠宰的成年奶牛的肌肉組織，Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Primes Star GXL Polymerase、pMD-19T（Simple）載體、Agarose Gel DNA Purification Kit、A-tailing試劑盒等購于寶生物（大連）有限公司、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司，pGEX-4T-1載體、DH5α、BH21菌種為本試驗(yàn)室保存。

1.2 TNMD基因的克隆

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)奶牛的TNMD基因序列（NM_001099948），分別設(shè)計TNMD的上、下游引物：5′-CGCGGATCCATGGCAAAGAATCCTCCAG

A -3′和 5′- CCGCTCGAGTTAAACCCTCCCCAGCAT

GC -3′。在上游引物5′端加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，下游引物5′端加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基（引物中下劃線部分），引物由寶生物（大連）有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR 取0.1 g 奶牛的肌肉組織，采用Trizol提取總RNA，溶解于30 ？滋L DEPC 水中備用。反轉(zhuǎn)錄體系為DEPC水 6.5 ？滋L、dNTP-Mix 4 ？滋L、5×AMV Buffer 4 ？滋L、Oligo d（T）18（50 pmol/L） 1 ？滋L、Ribonuclease Inhibitor（40 U/？滋L） 0.5 ？滋L、總 RNA 2 ？滋L、 AMV Reverse Transcriptase XL （5 U/？滋L） 2 ？滋L。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，72 ℃ 15 min，后冰浴2 min，得到cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中包括cDNA 2 ？滋L，GXL Polymerase （125 U/？滋L）0.2 ？滋L，dNTP （25 mmol/L） 2 ？滋L，Buffer 4 ？滋L，上下游引物（20 pmol/L）各1 ？滋L，反應(yīng)體系20 ？滋L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 s，58 ℃退火 45 s ，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行純化。

1.2.4 TNMD基因的克隆 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后末尾加Poly A，然后連接到pMD-19T載體上，轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，在含有氨芐的LB平板上鋪板。倒置培養(yǎng)過夜后，挑選陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測序正確的重組載體命名為T-TNMD。

1.2.5 TNMD基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定 將重組T載體質(zhì)粒T-TNMD和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1分別用BamHⅠ和 XhoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，分別電泳回收目的片段和載體酶切片段，將目的片段和載體片段按5∶1的比例用T4 DNA 連接酶在16 ℃連接1 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取重組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，雙酶切鑒定后將陽性克隆測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pGEX-TNMD。

1.2.6 TNMD基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 將pGEX-TNMD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌株，挑選單個菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時，在菌液OD600 nm的吸收值達(dá)到0.7時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.4 mmol/L，35 ℃繼續(xù)振蕩4 h，每小時取1次菌液（0.5 mL），離心收集菌體，加10 ？滋L 2×SDS加樣緩沖液，另加10 ？滋L水，振蕩混勻后沸水浴加熱5 min，用12%的SDS-PAGE凝膠電泳鑒定表達(dá)結(jié)果，同時以轉(zhuǎn)化不含目的基因的pGEX-4T-1質(zhì)粒的菌株為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛TNMD基因的克隆

由圖1可知，擴(kuò)增序列長度大約1 000 bp，與目的基因的序列長度相似。將目的片段切膠回收后連接克隆載體，轉(zhuǎn)化挑選陽性菌落測序，測序結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)其與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，序列全長為957 bp。

2.2 TNMD基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定

將質(zhì)粒T-TNMD和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1進(jìn)行雙酶切，電泳回收目的片段約為1 000 bp，原核表達(dá)載體pGEX-4T-1雙酶切后片段長度約為4 600 bp（圖2），切膠回收后將目的片段與原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定后（圖3）將陽性克隆測序，命名為pGEX-TNMD。

2.3 TNMD基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果

將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到的蛋白質(zhì)條帶大約59.68 kDa（圖4），和預(yù)期融合蛋白質(zhì)GST-TNMD的分子量一致。

3 小結(jié)與討論

人類的TNMD基因定位在X染色體（Xq22.1）上，包含有7個外顯子，最后一個外顯子構(gòu)成氨基酸C端的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，這8個半胱氨酸殘基在動物中序列高度保守，并且空間結(jié)構(gòu)與軟骨調(diào)節(jié)素（Chondromodulin，ChM）基因高度相似[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TNMD基因與機(jī)體的營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，TNMD的基因表達(dá)在肥胖患者脂肪組織中表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照人群，并且在體重降低的情況下，TNMD基因的表達(dá)也下調(diào)了[9]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TNMD基因的突變與肥胖人群血清中的低密度脂蛋白和總膽固醇的含量有關(guān)[7]，因此認(rèn)為TNMD基因能夠調(diào)控機(jī)體的膽固醇代謝。

本試驗(yàn)中選用的BL21是常用的原核表達(dá)菌株。BL21細(xì)胞基因組中的T7 啟動子能夠被IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后能夠增加其下游基因產(chǎn)物T7 RNA 聚合酶的表達(dá)，T7 RNA 聚合酶又能夠使轉(zhuǎn)入BL21細(xì)胞中的質(zhì)粒目的基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，進(jìn)而表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，IPTG誘導(dǎo)可以使BL21細(xì)胞表達(dá)更多目的蛋白質(zhì)。本研究構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-TNMD，在BL21大腸桿菌中成功表達(dá)了融合蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步制備其多克隆抗體，研究TNMD基因的作用位點(diǎn)及對奶牛營養(yǎng)代謝的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] DOCHEVA D， HUNZIKER E B， FASSLER R， et al. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation[J]. Molecular and Cellular Biology，2005，25（2）：699-705.

[2] YAMANA K， WADA H， TAKAHASHI Y，et al.Molecular cloning and characterization of CHM1L，a novel membrane molecule similar to chondromodulin-I[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，280（4）：1101-1106.

[3] KOLEHMAINEN M， SALOPURO T，SCHWAB U S， et al. Weight reduction modulates expression of genes involved in extracellular matrix and cell death： The GENOBIN study[J]. International Journal of Obesity，2008，32（2）：292-303.

[4] DAHLMAN I， LINDER K， ARVIDSSON N E，et al.Changes in adipose tissue gene expression with energy-restricted diets in obese women[J].The American Journal of Clinical Nutrition，2005，81（6）：1275-1285.

[5] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L，KOLEHMAINEN M，et al. Tenomodulin is associated with obesity and diabetes risk： The finnish diabetes prevention study[J].Obesity，2007，15（5）：1082-1088.

[6] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L，HERDER C， et al. The genetic variation of the tenomodulin gene （TNMD） is associated with serum levels of systemic immune mediators—the finnish diabetes prevention study[J]. Genet in Medicine，2008（10）：536-544.

[7] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L， KUULASMAA T， et al. The genetic variation in the tenomodulin gene is associated with serum total and LDL cholesterol in a body size-dependent manner[J].International Journal of Obersity，2008，32（12）：1868-1872.

[8] SHUKUNAMI C，HIRAKI Y.Chondromodulin-I and tenomodulin：The negative control of angiogenesis in connective tissue[J].Current Pharmaceutical Design，2007，13（20）；2101-2112.

[9] ATSUHITO S， MAJA O， MARGARETA J，et al. Tenomodulin is highly expressed in adipose tissue，increased in obesity， and down-regulated during diet-induced weight loss[J].The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2009，94（10）：3987-3994.

[5] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L，KOLEHMAINEN M，et al. Tenomodulin is associated with obesity and diabetes risk： The finnish diabetes prevention study[J].Obesity，2007，15（5）：1082-1088.

[6] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L，HERDER C， et al. The genetic variation of the tenomodulin gene （TNMD） is associated with serum levels of systemic immune mediators—the finnish diabetes prevention study[J]. Genet in Medicine，2008（10）：536-544.

[7] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L， KUULASMAA T， et al. The genetic variation in the tenomodulin gene is associated with serum total and LDL cholesterol in a body size-dependent manner[J].International Journal of Obersity，2008，32（12）：1868-1872.

[8] SHUKUNAMI C，HIRAKI Y.Chondromodulin-I and tenomodulin：The negative control of angiogenesis in connective tissue[J].Current Pharmaceutical Design，2007，13（20）；2101-2112.

[9] ATSUHITO S， MAJA O， MARGARETA J，et al. Tenomodulin is highly expressed in adipose tissue，increased in obesity， and down-regulated during diet-induced weight loss[J].The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2009，94（10）：3987-3994.

[5] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L，KOLEHMAINEN M，et al. Tenomodulin is associated with obesity and diabetes risk： The finnish diabetes prevention study[J].Obesity，2007，15（5）：1082-1088.

[6] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L，HERDER C， et al. The genetic variation of the tenomodulin gene （TNMD） is associated with serum levels of systemic immune mediators—the finnish diabetes prevention study[J]. Genet in Medicine，2008（10）：536-544.

[7] TOLPPANEN A M， PULKKINEN L， KUULASMAA T， et al. The genetic variation in the tenomodulin gene is associated with serum total and LDL cholesterol in a body size-dependent manner[J].International Journal of Obersity，2008，32（12）：1868-1872.

[8] SHUKUNAMI C，HIRAKI Y.Chondromodulin-I and tenomodulin：The negative control of angiogenesis in connective tissue[J].Current Pharmaceutical Design，2007，13（20）；2101-2112.

[9] ATSUHITO S， MAJA O， MARGARETA J，et al. Tenomodulin is highly expressed in adipose tissue，increased in obesity， and down-regulated during diet-induced weight loss[J].The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2009，94（10）：3987-3994.