李曉君　周文吉　周啟武等

摘要：將ShSAP1的閱讀框連接到原核表達(dá)載體pET32a（+）中，構(gòu)建成ShSAP1原核表達(dá)載體PET-ShSAP1，然后將其轉(zhuǎn)入宿主菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，宿主菌表達(dá)出與預(yù)期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白；將純化后的融合蛋白免疫家兔，獲得了ShSAP1的特異性抗血清；以融合蛋白作抗原，用間接ELISA法測定其抗血清效價為1 ∶25 000。

關(guān)鍵詞：甘蔗；ShSAP1；鋅指蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號： Q331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0043-03

逆境相關(guān)蛋白（stress assiated protein，SAP）是植物中一類含有A20與AN1鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，該蛋白家族與植物的非生物脅迫應(yīng)答密切相關(guān)。SAP基因的表達(dá)能夠被1種或多種非生物脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)SAP家族基因可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的對1種或多種脅迫的抗逆性[1]。目前關(guān)于SAP的作用機(jī)制還不是很清楚，研究發(fā)現(xiàn)SAP可能通過泛素蛋白酶途徑、蛋白相互作用或作為氧化還原感受器參與植物的逆境應(yīng)答過程[2-4]。ShSAP1（GenBank登錄號HM991960.1）是由甘蔗（Saccharum officinarum L.）中克隆到的SAP家族基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)具有逆境應(yīng)答特性[5]，目前正在開展ShSAP1的轉(zhuǎn)基因功能分析。本研究構(gòu)建了ShSAP1的原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行ShSAP1的蛋白表達(dá)與純化，并通過免疫家兔獲得了抗血清，為ShSAP1蛋白功能研究及的后續(xù)的轉(zhuǎn)基因檢測打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原核表達(dá)載體pET32a（+）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所劉志昕實(shí)驗(yàn)室惠贈，大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)購自天根生化科技有限公司。rTaq酶購自大連寶生物工程有限公司，限制性內(nèi)切酶，T4連接酶購自Fermantas公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司，蛋白Marker、蛋白純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Goat Anti-Rabbit IgG-AP與BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。本試驗(yàn)所用的引物序列如下，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 ShSAP1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

由甘蔗cDNA擴(kuò)增ShSAP1基因閱讀框，所用引物為PETZP1和PTEZP2，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。純化PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對純化后PCR產(chǎn)物和pET32a（+）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收PCR產(chǎn)物酶切片段和pET32a（+）大片段，用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α，重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證后送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，獲得原核表達(dá)載體pET-ShSAP1。

1.3 融合蛋白的小量表達(dá)

將pET32a（+）與測序驗(yàn)證后的原核表達(dá)載體pET-ShSAP1轉(zhuǎn)化BL21（DE3），挑取陽性單菌落接種于10 mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)至D=0.6～0.8，各取1 mL分裝于滅菌的1.5 mL EP管中，加等體積35%甘油，混勻，-70 ℃保存。試管中剩余菌液用加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng) 3～4 h。超聲波破碎菌體，取1.5 mL的EP管，分別取1 mL破碎后的菌液，12 000 r/min離心1 min。沉淀用100 μL的無菌水吹散。分別取10 μL上清和10 μL沉淀懸浮液進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min后進(jìn)行脫色，鑒定表達(dá)產(chǎn)物的存在形式及表達(dá)量。

1.4 融合蛋白的大量表達(dá)與純化

將小量表達(dá)驗(yàn)證過的pET32a（+）和pET-ShSAP1菌液進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑取陽性單菌落接種于10 mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃活化培養(yǎng)8 h后，以1 ∶100稀釋到400 mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至D600 nm值達(dá)到0.6～0.8，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)于 37 ℃ 培養(yǎng)8 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。8 000 r/min離心10 min，收集菌體，棄上清，加入30 mL Binding Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）重懸，使用超聲波破碎法在冰浴中對菌體進(jìn)行破碎，8 000 r/min離心10 min，分離裂解液上清保存，取10 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

蛋白純化：用6 mL滅菌水洗滌瓊脂糖樹脂2次后，以 6 mL Binding Buffer平衡親和柱。取6 mL裂解液上清上柱，用6 mL Wash Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脫雜蛋白，再分別以由低至高的咪唑濃度的6 mL Elute Buffer（500 mmol/L NaCl，50、100、200、500 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脫融合蛋白，取10 μL洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時，將純化蛋白送往北京華大基因測序中心進(jìn)行質(zhì)譜測序分析。選取濃度與純度較好的洗脫液進(jìn)行1×PBS透析，透析3次后進(jìn)行蛋白濃度測定既可用于免疫兔子，蛋白濃度（mg/mL）=1.45D280 nm-0.74D260 nm[6]。