羅茜

摘要：以油橄欖（Olea europaea L.）葉片為原料，以蘆丁為對照品，以乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比、回流時間為考察因素，以總黃酮提取率為指標，先通過單因素試驗，再采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選提取工藝。結(jié)果表明，最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)90 %、提取溫度60 ℃、料液比1∶19、回流時間1.5 h，在此條件下，總黃酮的提取率為2.280%。該提取工藝合理、簡單，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：正交設(shè)計；油橄欖（Olea europaea L.）葉；總黃酮

中圖分類號：S667.5；TS201.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）06-1406-03

Optimization of Extracting Total Flavonoids from Olive Leaf

LUO Qian

（School of Applied and Chemical Engineering， Xichang College，Xichang 615013， Sichuan，China）

Abstract： Using olive leaf as materials， rutin as control， and ethanol concentration， extraction temperature， material to solvent， refluxing extraction time as evaluation factors and the extraction rate of the total flavonoids as an indicator， the technology extracting the total flavonoids from olive leaf was optimized with single-factor experiment and orthogonal design. The results showed that the optimal technology were ethanol concentration 90%， extraction temperature 60 ℃， material to solvent 1∶19， refluxing extraction time 1.5 h. The extraction ratio of flavonoids was 2.2815% under the optimized conditions. The extraction method was reasonable and simple， and could be used for industrial production.

Key words： orthogonal experiment； olive（Olea europaea L.） leaf； total flavonoids

油橄欖（Olea europaea L.）為木犀科木樨欖屬植物，常綠闊葉喬木，又名洋橄欖、齊敦果[1]。最近幾年，隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，對營養(yǎng)保健的要求也逐年提高。油橄欖果雖可加工成素有“植物油皇后”之稱的橄欖油，但是我國的橄欖油產(chǎn)量并不大，目前主要依靠進口。國內(nèi)外對于橄欖油的報道較多，但是油橄欖的果渣、廢水和橄欖葉還鮮有研究報道。

國外的油橄欖葉提取物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和藥品[2]。油橄欖葉中活性成分主要有有機酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮等[3]，即說明可大力發(fā)展利用油橄欖葉片。

總黃酮是一類具有生理活性的物質(zhì)，廣泛分布于植物界中，它的生理活性形式多種多樣，總黃酮具有抗氧化，抗腫瘤等生物學(xué)功效，也具有其他的保健養(yǎng)生的功能。目前已從多種植物中提取出總黃酮[4-10]。因此從油橄欖葉片中提取總黃酮具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖葉片樣品由涼山州國家油橄欖良種基地提供，品種為科拉蒂。三氯化鋁（成都市科龍化工試劑廠）；95%乙醇（工業(yè)酒精），所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

98-1-BWAY-2S型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特有限公司）；WAY-2S型阿貝折射儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；722S型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；ZN-400A型微型高速粉碎機（長沙市岳麓區(qū)中南制藥廠）；ETTLERAE240型電子天平（瑞士METTLER公司）

1.3 試驗方法

1.3.1 材料預(yù)處理 將采摘的油橄欖葉片置于實驗室自然陰干，干燥后的油橄欖葉片于微型高速粉碎機粉碎，放在干燥器皿中備用。

1.3.2 單因素試驗 稱取10 g干燥的油橄欖葉片粉末，置于250 mL 圓底燒瓶中，在不同條件下提取，以確定提取因素變化范圍以及各因素的較佳值。

1.3.3 正交試驗 以乙醇、提取溫度、料液比、回流時間4個因素作為考察對象，采用正交試驗 L9（34）對樣品中的總黃酮進行提?。ū?），以總黃酮提取率為指標，進行試驗優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件。

1.3.4 標準曲線的繪制 從蘆丁標準溶液（0.079 2mg/mL）中精確移取 0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL蘆丁標準溶液置于25 mL容量瓶中，分別加30%乙醇至12.5 mL，搖勻，再分別加入10 mL 1%的AlCl3溶液，用30%乙醇溶液定容，搖勻放置15 min后，在415 nm下測定吸光度，結(jié)果見圖1。所得線性回歸方程A=29.904 0C+0.013 8，r2=0.999 6。

1.3.5 總黃酮測定方法 量取樣品溶液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.4”的方法測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響 稱取10 g樣品粉末，分別用 60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液為溶劑，然后在提取溫度80 ℃，料液比（m/v，g∶mL，下同）1∶13的條件下，水浴加熱回流2 h，真空抽濾兩次，常壓蒸餾回收乙醇，濃縮液用去離子水定容至250 mL，靜置沉淀24 h，取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL，即樣品溶液。取樣品溶液2.5 mL按照“1.3.4”的方法測定樣品溶液的吸光度，計算總黃酮的提取率，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，乙醇體積分數(shù)較低時，對原料的提取不夠完全，乙醇體積分數(shù)太大時就可能使一些脂溶性的雜質(zhì)溶解增加從而影響了總黃酮的溶出。所以乙醇體積分數(shù)為90%時油橄欖葉片中總黃酮的提取率最大。因此在保證原料的有效利用，經(jīng)濟價值最佳的情況下，生產(chǎn)提取油橄欖葉片中的總黃酮應(yīng)該選擇90%的乙醇為提取溶劑。

2.1.2 溫度對總黃酮提取率的影響 用90%乙醇，料液比1∶13，分別在40、50、60、70、80 ℃的條件下水浴加熱回流2 h，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，總黃酮的提取率隨溫度的升高而逐漸增加，提取溫度為70 ℃時提取率最大，70 ℃以后又逐漸降低。在40～70 ℃的范圍內(nèi)隨著溫度升高，分子運動加快，溶質(zhì)分子與溶劑分子能夠充分接觸，使總黃酮能夠更容易溶解到溶劑中，超過70 ℃后隨著熱效應(yīng)的影響，雜質(zhì)的溶出量開始增加，一些活性成分也會被破壞，所以綜合考慮提取溫度宜在70 ℃左右。

2.1.3 料液比對總黃酮提取率的影響 用90%乙醇，分別在料液比為1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21時的條件下進行提取試驗，溫度控制在70 ℃，水浴加熱回流2 h，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著料液比的降低總黃酮的提取率先增大后降低，在1∶19時提取率最大，而在1∶19至1∶21時提取率呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)料液比達到一定比例時，總黃酮已基本溶出，再降低料液比，可能由于總黃酮被反應(yīng)消耗了，反而降低總黃酮的提取效果。同時隨著溶劑量的增加，回收試劑的能耗就越高，不利于提高經(jīng)濟效益。因此，在確保提取效果的前提下，應(yīng)降低回收試劑消耗的成本，所以選擇料液比為1∶17。

2.1.4 回流時間對總黃酮提取率的影響 用90%的乙醇，料液比1∶19，提取溫度70 ℃的條件下，分別回流1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，隨著提取時間的延長，總黃酮的提取率先上升后下降。在1.0～2.0 h時范圍內(nèi)上升趨勢明顯，2.0 h達到最大值，2.0 h之后只有較小的下降趨勢。剛開始時由于時間較短總黃酮與溶劑還沒充分反應(yīng)，在2.0 h時提取率最大，時間超過2.0 h，溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇體積分數(shù)降低或者雜質(zhì)溶解增加影響了總黃酮的溶出，使總黃酮的提取率有所下降。

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗設(shè)計以確定最佳提取條件，根據(jù)表1進行正交試驗，得正交試驗結(jié)果如表2。從表2可知，乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比和回流時間這4個因素對總黃酮提取率影響主次順序為乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、回流時間，根據(jù)正交試驗得出最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)90%，料液比1∶19，提取溫度60 ℃，回流時間1.5 h。根據(jù)最佳條件得到油橄欖葉片的總黃酮含量為22.8 mg/g，最佳提取率為2.280%。

3 結(jié)論

通過以上初步試驗可以得出，單因素最佳條件為乙醇體積分數(shù)90%，提取溫度70 ℃，料液比1∶17，回流時間2.0 h。在單因素最佳基礎(chǔ)上進行的正交試驗得出最佳提取工藝即乙醇體積分數(shù)90%，提取溫度60 ℃，料液比1∶19，回流時間1.5 h。根據(jù)最佳提取工藝試驗得出油橄欖葉片中總黃酮含量為22.8 mg/g，油橄欖葉片中活性物質(zhì)總黃酮的最佳提取率達到2.280%。該方法簡單易行，對于油橄欖葉片的利用打下了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 白滿英，張金誠，崔育京.橄欖油的開發(fā)應(yīng)用[J].糧油食品科技，2003，11（2）：31-33，45.

[2] HEIMLER D，PIERONI A，TATTINI M，et al.Determination of flavonoids，flavonoid glycosides and bliflavonoids in Olea europaea L.leaves[J]. Chromatographia，1992，33（7-8）：369-373.

[3] 朱靜平.油橄欖葉中活性成份初步分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012， 51（15）：3315-3317.

[4] 許 暉，孔蘭萍，張 斌，等.花生殼總黃酮乙醇提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（8）：135-139.

[5] 陳育平.正交分析法篩選陳皮總黃酮的提取溶劑[J].大家健康（學(xué)術(shù)版），2012（12）：4-6.

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[7] 鄭國華，許 潔，李能發(fā).不同提取方法對霉茶中總黃酮含量的影響[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，8（1）：35-36.

[8] 王 凱.寧夏沙棗中總黃酮的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（14）：8343-8344，8347.

[9] 白喜婷，朱文學(xué)，羅 磊，等.杜仲雄花茶中黃酮類化合物的提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（11）：96-100.

[10] 鄭媛媛，李 辰，封士蘭，等.油橄欖葉中總黃酮含量測定方法探討[J].光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（2）：547-550.

1.3.5 總黃酮測定方法 量取樣品溶液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.4”的方法測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響 稱取10 g樣品粉末，分別用 60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液為溶劑，然后在提取溫度80 ℃，料液比（m/v，g∶mL，下同）1∶13的條件下，水浴加熱回流2 h，真空抽濾兩次，常壓蒸餾回收乙醇，濃縮液用去離子水定容至250 mL，靜置沉淀24 h，取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL，即樣品溶液。取樣品溶液2.5 mL按照“1.3.4”的方法測定樣品溶液的吸光度，計算總黃酮的提取率，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，乙醇體積分數(shù)較低時，對原料的提取不夠完全，乙醇體積分數(shù)太大時就可能使一些脂溶性的雜質(zhì)溶解增加從而影響了總黃酮的溶出。所以乙醇體積分數(shù)為90%時油橄欖葉片中總黃酮的提取率最大。因此在保證原料的有效利用，經(jīng)濟價值最佳的情況下，生產(chǎn)提取油橄欖葉片中的總黃酮應(yīng)該選擇90%的乙醇為提取溶劑。

2.1.2 溫度對總黃酮提取率的影響 用90%乙醇，料液比1∶13，分別在40、50、60、70、80 ℃的條件下水浴加熱回流2 h，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，總黃酮的提取率隨溫度的升高而逐漸增加，提取溫度為70 ℃時提取率最大，70 ℃以后又逐漸降低。在40～70 ℃的范圍內(nèi)隨著溫度升高，分子運動加快，溶質(zhì)分子與溶劑分子能夠充分接觸，使總黃酮能夠更容易溶解到溶劑中，超過70 ℃后隨著熱效應(yīng)的影響，雜質(zhì)的溶出量開始增加，一些活性成分也會被破壞，所以綜合考慮提取溫度宜在70 ℃左右。

2.1.3 料液比對總黃酮提取率的影響 用90%乙醇，分別在料液比為1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21時的條件下進行提取試驗，溫度控制在70 ℃，水浴加熱回流2 h，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著料液比的降低總黃酮的提取率先增大后降低，在1∶19時提取率最大，而在1∶19至1∶21時提取率呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)料液比達到一定比例時，總黃酮已基本溶出，再降低料液比，可能由于總黃酮被反應(yīng)消耗了，反而降低總黃酮的提取效果。同時隨著溶劑量的增加，回收試劑的能耗就越高，不利于提高經(jīng)濟效益。因此，在確保提取效果的前提下，應(yīng)降低回收試劑消耗的成本，所以選擇料液比為1∶17。

2.1.4 回流時間對總黃酮提取率的影響 用90%的乙醇，料液比1∶19，提取溫度70 ℃的條件下，分別回流1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，隨著提取時間的延長，總黃酮的提取率先上升后下降。在1.0～2.0 h時范圍內(nèi)上升趨勢明顯，2.0 h達到最大值，2.0 h之后只有較小的下降趨勢。剛開始時由于時間較短總黃酮與溶劑還沒充分反應(yīng)，在2.0 h時提取率最大，時間超過2.0 h，溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇體積分數(shù)降低或者雜質(zhì)溶解增加影響了總黃酮的溶出，使總黃酮的提取率有所下降。

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗設(shè)計以確定最佳提取條件，根據(jù)表1進行正交試驗，得正交試驗結(jié)果如表2。從表2可知，乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比和回流時間這4個因素對總黃酮提取率影響主次順序為乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、回流時間，根據(jù)正交試驗得出最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)90%，料液比1∶19，提取溫度60 ℃，回流時間1.5 h。根據(jù)最佳條件得到油橄欖葉片的總黃酮含量為22.8 mg/g，最佳提取率為2.280%。

3 結(jié)論

通過以上初步試驗可以得出，單因素最佳條件為乙醇體積分數(shù)90%，提取溫度70 ℃，料液比1∶17，回流時間2.0 h。在單因素最佳基礎(chǔ)上進行的正交試驗得出最佳提取工藝即乙醇體積分數(shù)90%，提取溫度60 ℃，料液比1∶19，回流時間1.5 h。根據(jù)最佳提取工藝試驗得出油橄欖葉片中總黃酮含量為22.8 mg/g，油橄欖葉片中活性物質(zhì)總黃酮的最佳提取率達到2.280%。該方法簡單易行，對于油橄欖葉片的利用打下了一定的基礎(chǔ)。

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[8] 王 凱.寧夏沙棗中總黃酮的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（14）：8343-8344，8347.

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[10] 鄭媛媛，李 辰，封士蘭，等.油橄欖葉中總黃酮含量測定方法探討[J].光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（2）：547-550.

1.3.5 總黃酮測定方法 量取樣品溶液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.4”的方法測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響 稱取10 g樣品粉末，分別用 60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液為溶劑，然后在提取溫度80 ℃，料液比（m/v，g∶mL，下同）1∶13的條件下，水浴加熱回流2 h，真空抽濾兩次，常壓蒸餾回收乙醇，濃縮液用去離子水定容至250 mL，靜置沉淀24 h，取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL，即樣品溶液。取樣品溶液2.5 mL按照“1.3.4”的方法測定樣品溶液的吸光度，計算總黃酮的提取率，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，乙醇體積分數(shù)較低時，對原料的提取不夠完全，乙醇體積分數(shù)太大時就可能使一些脂溶性的雜質(zhì)溶解增加從而影響了總黃酮的溶出。所以乙醇體積分數(shù)為90%時油橄欖葉片中總黃酮的提取率最大。因此在保證原料的有效利用，經(jīng)濟價值最佳的情況下，生產(chǎn)提取油橄欖葉片中的總黃酮應(yīng)該選擇90%的乙醇為提取溶劑。

2.1.2 溫度對總黃酮提取率的影響 用90%乙醇，料液比1∶13，分別在40、50、60、70、80 ℃的條件下水浴加熱回流2 h，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，總黃酮的提取率隨溫度的升高而逐漸增加，提取溫度為70 ℃時提取率最大，70 ℃以后又逐漸降低。在40～70 ℃的范圍內(nèi)隨著溫度升高，分子運動加快，溶質(zhì)分子與溶劑分子能夠充分接觸，使總黃酮能夠更容易溶解到溶劑中，超過70 ℃后隨著熱效應(yīng)的影響，雜質(zhì)的溶出量開始增加，一些活性成分也會被破壞，所以綜合考慮提取溫度宜在70 ℃左右。

2.1.3 料液比對總黃酮提取率的影響 用90%乙醇，分別在料液比為1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21時的條件下進行提取試驗，溫度控制在70 ℃，水浴加熱回流2 h，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著料液比的降低總黃酮的提取率先增大后降低，在1∶19時提取率最大，而在1∶19至1∶21時提取率呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)料液比達到一定比例時，總黃酮已基本溶出，再降低料液比，可能由于總黃酮被反應(yīng)消耗了，反而降低總黃酮的提取效果。同時隨著溶劑量的增加，回收試劑的能耗就越高，不利于提高經(jīng)濟效益。因此，在確保提取效果的前提下，應(yīng)降低回收試劑消耗的成本，所以選擇料液比為1∶17。

2.1.4 回流時間對總黃酮提取率的影響 用90%的乙醇，料液比1∶19，提取溫度70 ℃的條件下，分別回流1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，隨著提取時間的延長，總黃酮的提取率先上升后下降。在1.0～2.0 h時范圍內(nèi)上升趨勢明顯，2.0 h達到最大值，2.0 h之后只有較小的下降趨勢。剛開始時由于時間較短總黃酮與溶劑還沒充分反應(yīng)，在2.0 h時提取率最大，時間超過2.0 h，溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇體積分數(shù)降低或者雜質(zhì)溶解增加影響了總黃酮的溶出，使總黃酮的提取率有所下降。

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗設(shè)計以確定最佳提取條件，根據(jù)表1進行正交試驗，得正交試驗結(jié)果如表2。從表2可知，乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比和回流時間這4個因素對總黃酮提取率影響主次順序為乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、回流時間，根據(jù)正交試驗得出最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)90%，料液比1∶19，提取溫度60 ℃，回流時間1.5 h。根據(jù)最佳條件得到油橄欖葉片的總黃酮含量為22.8 mg/g，最佳提取率為2.280%。

3 結(jié)論

通過以上初步試驗可以得出，單因素最佳條件為乙醇體積分數(shù)90%，提取溫度70 ℃，料液比1∶17，回流時間2.0 h。在單因素最佳基礎(chǔ)上進行的正交試驗得出最佳提取工藝即乙醇體積分數(shù)90%，提取溫度60 ℃，料液比1∶19，回流時間1.5 h。根據(jù)最佳提取工藝試驗得出油橄欖葉片中總黃酮含量為22.8 mg/g，油橄欖葉片中活性物質(zhì)總黃酮的最佳提取率達到2.280%。該方法簡單易行，對于油橄欖葉片的利用打下了一定的基礎(chǔ)。

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