韓悅，任洪杰，翟笑雨，徐啟江*

(1.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150040；2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

羽衣甘藍(lán)MADS–box基因BoaAGL6的克隆及表達(dá)分析

韓悅1,2，任洪杰1,2，翟笑雨1,2，徐啟江1,2*

(1.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150040；2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

以羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var. acephala)野生型及其在選育過程中發(fā)現(xiàn)的2種花瓣數(shù)量變化的突變體品種為試材，通過RACE方法克隆了AGL6基因的同源基因，命名為BoaAGL6，并用半定量RT–PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了BoaAGL6在3種不同花型的羽衣甘藍(lán)各類花器官的表達(dá)模式。結(jié)果表明：克隆的BoaAGL6基因長999 bp(GenBank登錄號為KC984301)，開放閱讀框長759 bp，編碼252個(gè)氨基酸；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BoaAGL6基因?qū)儆贏GL6–like進(jìn)化系；半定量RT–PCR和實(shí)時(shí)定量RT–PCR 結(jié)果表明，BoaAGL6基因具有較寬泛的表達(dá)區(qū)域，在不同花型的花瓣中的表達(dá)有所區(qū)別，在多瓣花型的花瓣中高豐度表達(dá)，有別于在其他2種花型中的中等水平。說明該基因在調(diào)控羽衣甘藍(lán)花器官特征屬性及形成過程中發(fā)揮重要作用。

羽衣甘藍(lán)；花發(fā)育；MADS–box基因；BoaAGL6基因

花發(fā)育MADS–box基因在植物的花分生組織、花器官和各種營養(yǎng)器官中均有不同形式的時(shí)空表達(dá)模式，有著各自不同的功能。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在12個(gè)Ⅱ型MADS–box基因亞家族中，AP1、SEP 和AGL6(AGAMOUS–like 6)由于存在較近的親緣關(guān)系而構(gòu)成 AP1/SEP/AGL6進(jìn)化系[1–2]，其中 AGL6 與SEP互為姊妹系；AGL6/SEP與AP1互為姊妹系[1]。AP1亞家族基因在發(fā)育的花分生組織和初始的花器官原基中表達(dá)。擬南芥基因組中存在 4個(gè)AP1–like基因：AP1、FRUITFULL(FUL)、AGL79和CAULIFLOWER (CAL)，其中AP1、FUL和CAL在調(diào)控花分生組織屬性方面存在功能冗余[3]。擬南芥SEP1/2/3/4基因，主要參與調(diào)控四輪花器官的特征屬性和花分生組織的確定性[4–6]。然而，擬南芥AGL6基因的直系同源基因AGL6–like基因的功能迄今為止還不是十分明確[2]。但是，也有研究表明，在擬南芥35S:AGL6過表達(dá)株系和激活標(biāo)簽突變體中，AGL6能夠激活開花時(shí)間關(guān)鍵因子FLOWERING LOCUS C(FLC)和FLOWERING LOCUS T(FT)[7]；矮牽牛的PhAGL6和SEP–like基因在調(diào)控花瓣和花藥發(fā)育方面存在功能冗余[8]。

已從裸子植物和所有主要被子植物中獲得AGL6亞家族成員[9]。AGL6–like在花分生組織中的表達(dá)模式具有保守性[10]。但是也有研究表明，該類基因能在擬南芥及裸子植物的營養(yǎng)器官中表達(dá)[11]，例如，擬南芥AGL6在莖生葉原基和花誘導(dǎo)形成的潛在苞葉區(qū)表達(dá)[12]；PrMADS3在葉芽起始針葉原基的細(xì)胞群中表達(dá)，說明在被子植物起源之前，AGL6進(jìn)化系具有調(diào)控營養(yǎng)發(fā)育的功能。隨著研究的不斷深入，AGL6–like基因的多樣性功能不斷被闡釋。例如，水稻 MFO1具有調(diào)控花器官屬性和花分生組織確定性功能，Mfol突變體小花的內(nèi)稃和漿片發(fā)育不正常、花器官融合以及產(chǎn)生額外的花器官[13]；玉米的ZAG3基因在花分生組織中表達(dá)，而在外稃和雄蕊中無表達(dá)，在花發(fā)育的后期，ZAG3在發(fā)育的漿片、內(nèi)稃、心皮和內(nèi)珠被中表達(dá)，缺失突變證實(shí)該基因同樣具有調(diào)控花器官屬性和花分生組織確定性的功能[14]。了解AGL6–like基因的原始功能及其多樣性的分化功能，需要擴(kuò)展研究的植物范圍。

羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var. acephala)的花具有典型雙子葉植物花的結(jié)構(gòu)，由 4枚萼片、4枚花瓣、6枚雄蕊、1枚雌蕊構(gòu)成。在新品種選育過程中，筆者獲得了穩(wěn)定遺傳花瓣增多和花瓣減少突變體，其萼片、雄蕊、雌蕊發(fā)育正常，但花瓣數(shù)目增多或減少。本研究以羽衣甘藍(lán)花芽為試材，利用cDNA 末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)獲得了1個(gè)與花發(fā)育相關(guān)的AGL6基因，通過半定量RT–PCR和實(shí)時(shí)定量RT–PCR分析了BoaAGL6基因的時(shí)空表達(dá)模式，以探討 BoaAGL6基因在羽衣甘藍(lán)花器官發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試羽衣甘藍(lán)

羽衣甘藍(lán)自交系14號(花瓣數(shù)目正常，4枚)、自交系變異株羽衣甘藍(lán)5號(多瓣，8枚以上)、自交系變異株羽衣甘藍(lán)20號(少瓣，0～3枚)品系均由東北林業(yè)大學(xué)花卉生物工程研究所提供。羽衣甘藍(lán)種植于溫室內(nèi)，常規(guī)栽培管理，2月中旬開始現(xiàn)蕾。供試3種材料的遺傳背景相同，除花瓣數(shù)目有差異外，其他性狀完全相同。

1.2 RNA 提取、MADS–box同源基因克隆

使用TRIzol(invitrogen)試劑提取羽衣甘藍(lán)常規(guī)品種14號花芽的總RNA，用NanoDrop(NanoDrop technologies)分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠檢測總 RNA的質(zhì)量和濃度。利用P19E(表1)、第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、以5 μg 總RNA為模板合成第一鏈cDNA。

表1 羽衣甘藍(lán)BoaAGL6基因克隆及表達(dá)分析用引物Table 1 List of primers used for cloning and expression analysis of BoaAGL6 from kale

利用 cDNA 末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)法克隆3′–cDNA序列，根據(jù)GenBank中與羽衣甘藍(lán)親緣關(guān)系相近物種的MADS–box基因保守區(qū)的核苷酸序列設(shè)計(jì)MADS–box基因特異簡并引物(表 1)。以第一鏈cDNA為模板，利用MADS–box基因特異簡并引物、P18E引物(表1)、TransTaqTMHIFI DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸 7 min。PCR產(chǎn)物用 PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Genestar)回收后用T載體克隆，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

根據(jù)獲得的 3′–cDNA序列設(shè)計(jì)引物 BoaAG L6GSP1、BoaAGL6GSP2(表1)，利用BoaAGL6GSP1和錨定引物以加 dA尾的 cDNA 為模板進(jìn)行5′–RACE擴(kuò)增。為保證克隆片段的特異性，再用巢式引物 BoaAGL6GSP2和接頭引物進(jìn)行第二次5′–RACE擴(kuò)增，克隆5′–cDNA序列，PCR產(chǎn)物的回收純化、克隆、測序同3′–RACE產(chǎn)物。

1.3 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確本研究分離基因所屬的MADS–box亞家族，將克隆的基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得與克隆基因序列高度相似的同源基因，然后用 ClustalX1.83軟件進(jìn)行序列比對，用GeneDoc3.2軟件進(jìn)行手工調(diào)整，并且將核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列。用 MEGA6軟件[15]的鄰位相連法(Neighbor–joining，NJ)對氨基酸矩陣進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。NJ系統(tǒng)樹分支的置信度采用重復(fù)抽樣分析的方法，重復(fù)抽樣的次數(shù)為1 000次，大于50%的bootstrap 標(biāo)注在樹圖上。

1.4 基于半定量RT–PCR和 qRT–PCR的BoaAGL6基因表達(dá)分析

提取3種花型的萼片、第一輪花瓣、第二輪花瓣、雄蕊、心皮、子房的總RNA。以各類花器官的總RNA為模板，利用oligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行基因特異性PCR，以18S基因?yàn)閮?nèi)參。

半定量RT–PCR在PE–9700型PCR儀上進(jìn)行，所用引物為 BoaAGL6–Realtime–F、BoaAGL6–Realtime–R(表1)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；25個(gè)循環(huán)(94 ℃ 預(yù)變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃ 終延伸 7 min。用0.8%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。

用7500 fast 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和Power SYBR?Green PCR Master MiX試劑盒 (Applied Biosystems)以上述花器官的 cDNA為模板進(jìn)行BoaAGL6基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析；20 μL反應(yīng)體系中包括8.4 稀釋的第一鏈cDNA模板(1μg cDNA 加 420μL水稀釋)、濃度為 10 μmol/L 的引才、物BoaAGL6–Realtime–F、BoaAGL6– Realtime–R各0.8 μL、Power SYBR?Green PCR Master MiX(2×)10 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 2 min；隨后40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95 10 s℃ ，60 45 s)℃ 。以18S基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平為內(nèi)參，采用2–ΔΔCT法[16]分析BoaAGL6基因的相對表達(dá)水平。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在同一批次內(nèi)完成內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽衣甘藍(lán)花器官特征基因 BoaAGL6的克隆及序列比對

3′–RACE得到的測序結(jié)果表明，該片段有效長度為 841 bp，其核苷酸序列與擬南芥(Arabidopsis thaliana)AGL6基因核苷酸序列具有87%的相似性，為AGAMOUS–like 6 (AGL6)基因，因而將從羽衣甘藍(lán)中克隆的AGL6基因命名為BoaAGL6。

以 3′–RACE序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 5′–RACE擴(kuò)增，克隆后測序結(jié)果表明，該片段長度為405 bp，在5′端36 bp 處發(fā)現(xiàn)起始密碼子。拼接測序結(jié)果，得到長度為999 bp的BoaAGL6基因cDNA序列。GenBank登錄號為KC984301。其開放閱讀框長759 bp，編碼252個(gè)氨基酸，含有56個(gè)氨基酸的MADS結(jié)構(gòu)域、33個(gè)氨基酸的I結(jié)構(gòu)域、77個(gè)氨基酸的K結(jié)構(gòu)域、86個(gè)氨基酸的C結(jié)構(gòu)域(圖1)。

與其他 MADS–box蛋白的多重氨基酸序列比對結(jié)果表明，BoaAGL6蛋白擁有典型的MIKC–type結(jié)構(gòu)(圖1)，與VvMADS3(葡萄)、AtAGL6(擬南芥)、BoAGL6a(花椰菜)和BoAGL6b(花椰菜)等具有較高的序列相似性。在AGL6–like蛋白C–末端有2個(gè)高度保守的基序 AGL6–I motif和 AGL6–II motif[17](圖2)，與SEP I/II motifs高度相似，有潛在的轉(zhuǎn)錄激活活性[13]。

圖1 羽衣甘藍(lán)BoaAGL6 cDNA的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of BoaAGL6 cDNA from kale

圖2 部分AGL6和SEP基因的氨基酸序列Fig. 2 Sequence alignment of amino acid sequences among several AGL6–like and SEP–like genes

2.2 BoaAGL6基因與其他MADS–box基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

AGL6–like基因是MADS–box中重要的亞家族之一，據(jù)報(bào)道它與SEP和AP1亞家族親緣關(guān)系較近[18]。為確定羽衣甘藍(lán) BoaAGL6基因的系統(tǒng)發(fā)育位置，從GenBank數(shù)據(jù)庫中收集了71個(gè)AGL6 –like類、SEP–like類、AP1類亞家族MADS–box基因用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。對M、I、K、C區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行NJ分析而構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)表明，相同目物種的AGL6同源蛋白具有較高的自展支持率，BoaAGL6被歸入AGL6同源蛋白單元組，并與真雙子葉植物擬南芥AGL6與AGL13(M55554、U20183)、花椰菜BoAGL6a與BoAGL6b(AJ508055 AJ508409)、鱗莖毛茛 RbAGL6(AY306184)、葡萄VvMADS3(AF373602)等聚為一支，屬于 euAGL6進(jìn)化系。

圖3 以鄰位相連構(gòu)建的AGL6–like亞家族MADS–box蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The phylogenetic tree of AGL6–like MADS–box proteins generated using the Neighbor–joining method

2.3 BoaAGL6基因在羽衣甘藍(lán)各花器官中的表達(dá)模式

半定量RT–PCR和 qRT–PCR結(jié)果表明，羽衣甘藍(lán)AGL6–like基因BoaAGL6 特異地在花器官中表達(dá)(圖4)。3種花型中，在雄蕊、子房中高豐度表達(dá)，在萼片和雌蕊中表現(xiàn)為弱表達(dá)量。在自交系變異株羽衣甘藍(lán)5號的第二輪花瓣中BoaAGL6的表達(dá)明顯高于羽衣甘藍(lán)自交系 14號和自交系變異株羽衣甘藍(lán)20號。BoaAGL6蛋白的 C–末端具有該進(jìn)化系典型性的AGL6–Ⅰ motif 和AGL6–Ⅱ motif。系統(tǒng)發(fā)育分析表

圖4 羽衣甘藍(lán)BoaAGL6基因的半定量RT–PCR結(jié)果Fig.4 Quantification of expression levels of the BoaAGL6 gene in deferent floral organs of kale as determined by gene-specific semi-quantitative RT–PCR

圖5 羽衣甘藍(lán)BoaAGL6基因的qRT–PCR分析結(jié)果Fig. 5 Quantification qRT–PCR analysis of the BoaAGL6 gene in kale

3 討 論

1) BoaAGL6基因的歸屬。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，MADS–box基因家族中的AGL6亞家族在其系統(tǒng)發(fā)育史中經(jīng)歷了5次基因復(fù)增事件。前2次基因復(fù)增事件分別發(fā)生在百合目和天門冬目產(chǎn)生之前；在木蘭類植物分化期間發(fā)生第3次重增；第4次重增事件發(fā)生在核心真雙子葉植物起始之前，產(chǎn)生了euAGL6和AGL6–like基因[2]。AGL6亞家族的系統(tǒng)發(fā)育史可以追溯到核心真雙子葉植物起源之時(shí)，這表明核心真雙子葉植物的AGL6祖先基因通過基因組復(fù)制而產(chǎn)生多個(gè)旁系同源基因，其中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能的旁系同源基因被優(yōu)先保存下來[1,19]。此外，MADS–box基因也可以通過多次獨(dú)立的復(fù)制事件而產(chǎn)生旁系同源基因。在被子植物中，euAGL6進(jìn)化系的數(shù)量遠(yuǎn)多于 AGL6–like進(jìn)化系的數(shù)量[2,12]。羽衣甘藍(lán)中只存在euAGL6基因即BoaAGL6基因。明，采用不同的外部類群(SOC1類和B類)和不同的計(jì)算方法(ML法和Mrbayes法)所得到的基因樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，E類和AGL6類為姊妹類群，而A類基因是這兩類基因的姊妹類群。AGL6蛋白C末端的的2個(gè)motif和SEP類蛋白C末端的兩個(gè)motif更為相近，SEP類和AGL6類蛋白在K3區(qū)擁有共同的PRODOM結(jié)構(gòu)域(PD352768)。

2) BoaAGL6基因的表達(dá)模式。AGL6世系在花分生組織中的表達(dá)自被子植物多樣化以來就是保守的[2]。本研究結(jié)果表明AGL6與SEP互為姊妹系[1]。BoaAGL6在所有的花器官中都表達(dá)，說明BoaAGL6基因參與了所有花器官的屬性決定，與“ABCE”模型[20]中E功能基因的表達(dá)范圍相符。在雄蕊與子房中表達(dá)最高，而在3種花瓣數(shù)量不同的花型中，在多瓣花的第二輪花瓣中，BoaAGL6的表達(dá)明顯高于野生型和少瓣突變體，依照“ABCE”模型推測，花瓣變化的表型可能是與 A、B、E功能基因表達(dá)發(fā)生改變或是由于 C功能基因表達(dá)區(qū)域的變化有關(guān)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可推測 BoaAGL6在一定程度上影響羽衣甘藍(lán)突變體花瓣的變化。下一步需要克隆羽衣甘藍(lán)其他 A、B、C、E基因，探討其構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)在花瓣變化的羽衣甘藍(lán)表型中的整體功能。

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Cloning and expression analysis of MADS–box gene BoaAGL6 associated with floral development in kale (Brassica oleracea var. acephala)

HAN Yue1,2，REN Hong-jie1,2，ZHAI Xiao-yu1,2，XU Qi-jiang1,2*
(1.The State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Harbin 150040, China; 2.College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Wild type kales (Brassica oleracea var.acephala) and its two mutants which have different petals in number were used as material. One AGL6-homologue from conventional kale varieties denoted as BoaAGL6 was cloned using RACE (rapid amplification of cDNA ends), then expression pattern of BoaAGL6 in each floral organ was examined. The results showed that BoaAGL6 contains a 759 bp open reading frame that encodes a deduced protein with 252 amino acid residues. Phylogenetic analysis indicated that BoaAGL6 belongs to the AGL6-like subfamily. The result from multiple methods (semi-quantitative RT–PCR and quantitative real-time PCR) revealed that the pattern of the expression of BoAGL6 is broader than those of their counterparts in eudicots, with different expression levels in petals, which is high in mutants with the most petals. These results suggest that BoaAGL6 plays important roles in controlling floral organ identity and formation in kale.

kale (Brassica oleracea var.acephala); flower development; MADS–box genes; BoaAGL6 gene

S635.9

A

1007?1032(2014)05?0487?07

10.13331/j.cnki.jhau.2014.05.007

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2014–05–08

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201016)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2013RFLXJ015)

韓悅(1989—)，女，吉林吉林人，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育研究，hanyue9488@126.com；*通信作者，qijiangxu@126.com