李 龍，徐勝勇*，張 輝，柳本卓，高天翔

(1．中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003;2．中國科學院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境重點實驗室，山東 青島 266071;3．日本水產綜合研究中心中央水產研究所，神奈川 橫濱 236－8648)

0 引言

耳石是魚類內耳中碳酸鈣的結晶體，其形態(tài)具有種類和群系的特異性[1－2]．由于受溫度、鹽度、光照等環(huán)境因素影響，不同地理群體魚類耳石形態(tài)可能存在差異[3－5]．隨著圖像處理技術及圖形分析軟件 (如Image－Pro plus、SPSS等)的發(fā)展，耳石形態(tài)學分析已被廣泛應用于種內和種間的群體比較研究．國外學者[6－8]對魚類不同地理群體間耳石形態(tài)進行了比較研究，20世紀90年代以來，國內學者也開展了許多不同群體耳石形態(tài)學的研究工作[2，9－14]．

褐菖鲉 (Sebastiscus marmoratus Cuvier，1829)屬鲉形目 (Scorpaeniformes)、鲉科 (Scorpaenidae)、菖鲉屬，俗名石頭鱸、虎頭魚等，廣泛分布于中國、日本、朝鮮及菲律賓沿海[15]．褐菖鲉為卵胎生魚類，常棲息于近岸巖礁海區(qū)，隨季節(jié)變化進行有規(guī)律地短距離遷移[15－16]．褐菖鲉為肉食性魚類，主要捕食小型魚類，其肉質細嫩，味道鮮美．由于近海漁業(yè)資源不斷衰退，褐菖鲉的經濟價值有所提升．到目前為止，已有一些關于褐菖鲉的生物學及增養(yǎng)殖技術研究報道[14，17]，但尚未見關于褐菖鲉群體耳石形態(tài)學的相關研究．本研究采集了中國和日本近海4個褐菖鲉群體，對101尾個體的8個耳石形狀指標和77個橢圓傅里葉參數進行了多元統計分析，探討褐菖鲉中國、日本群體耳石形態(tài)差異，以期為褐菖鲉資源利用與管理提供基礎資料，研究結果也將豐富魚類種群耳石形態(tài)學研究．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用褐菖鲉樣品于2010年至2012年采自日本伯方島、橫須賀和中國惠州、海口，各群體樣品信息參見表1．文獻 [16]研究表明褐菖鲉2—5月繁殖，完全性成熟體長在120 mm左右，雌魚性成熟最小體長為90 mm．從采樣時間和樣品體長范圍分析，其實驗所用褐菖鲉樣品應為性成熟個體．因而本實驗剔除未達性成熟個體后再進行常規(guī)生物學測定，并取左右矢耳石備用．

表1 褐菖鲉樣品信息Tab.1 Sample information of S．marmoratus

1.2 實驗方法

1.2.1 耳石形狀指標的測定

將褐菖鲉耳石按編號順序放入離心管中保存，加蒸餾水浸泡1 h后，使用KQ3200型超聲波清洗儀清洗30 min，再放入50℃烘箱中烘干至恒重．將烘干的左、右矢耳石用電子天平稱重 (精度為0.01 mg)．用連于解剖鏡 (型號Nikon SMZ1000)的數碼相機 (型號Nikon DN100)按照編號順序對耳石進行拍照．用圖像分析軟件Image－Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，2006)對獲得的二維耳石照片進行分析，得出以下8個耳石尺寸參數:耳石周長(P)、耳石長(FL)、耳石寬(FW)、耳石面積(A)、耳石最大半徑(Rmax)和最小半徑(Rmin)、耳石最大Feret徑長(Fmax)和最小Feret徑長(Fmin)．利用8個耳石尺寸參數得到耳石的形狀指標[11，18－19]:環(huán)率(circularity)C=P2/A;形態(tài)因子(format-factor)FF=4πA/P2;幅形比(aspect ratio)AR=FL/FW;圓度(roundness)RO=4A/πF2L;Feret比(Feret ratio)FR=Fmax/Fmin;橢圓率(ellipticity)E=(FL-FW)/(FL+FW);矩形趨近率(rectangularity)RE=A/(FL*FW);半徑比(radius ratio)RR=Rmax/Rmin．

1.2.2 橢圓傅里葉參數

橢圓傅里葉分析方法是通過將耳石外部輪廓數字化，比較分析耳石輪廓曲線的數學表達式系數，從而對耳石外部輪廓形態(tài)進行研究．耳石的外部輪廓曲線主要由前20個傅里葉諧值描述，每個諧值由4個形態(tài)變量 an、bn、cn和 dn表示[2，20－21]．應用 Shape軟件包[22]對耳石二維影像進行灰階轉換、二值化處理、噪音消除等操作后得到傅里葉諧函數 (Elliptic Fourier descriptors，EFDs)，依次使用Chaincoder.exe、CHC2NEF.exe和PrinComp.exe軟件包將傅里葉諧函數轉換為傅里葉諧值，進而得到77個橢圓傅里葉參數．

1.2.3 數據分析

對8個耳石形狀指標和77個橢圓傅里葉參數進行數據分析:

1)判別分析 應用Fisher判別法對85個指標進行逐步判別分析 (Discriminant analysis)，構建判別函數和判別散點圖并計算各群體判別準確率及綜合判別準確率．

2)聚類分析 應用組間聯接的聚類方法，對85個指標進行聚類分析 (Cluster analysis)，使用平方Euclidean距離系數，構建聚類關系樹．

3)主成分分析 對85個指標進行主成分分析 (Principal component analysis)，得到各主成分載荷值和貢獻率，構建主成分散點圖．

2 結果

2.1 褐菖鲉雌雄個體耳石差異

從4個群體101尾褐菖鲉樣品中選取體長相近的雌雄個體各30尾，使用獨立樣本t檢驗對其耳石原始測量數據進行差異性分析，結果顯示褐菖鲉雌雄耳石差異不顯著(P〉0.05)(見表2)．對褐菖鲉耳石統一采用左耳石凹面的測量數據進行分析．

表2 褐菖鲉雌雄個體耳石差異分析Tab.2 The analysis of variation for the male and female otolith of S．marmoratus

2.2 判別分析結果

對4個群體101尾褐菖鲉樣品的85個耳石形態(tài)學指標進行逐步判別分析，結果顯示4個群體判別正確率為79.2% ～100%，其中惠州群體判別正確率為100%，綜合判別正確率為89.1%(見表3)．

根據判別分析結果構建的各群體判別函數如下:

Y?？?927．6D5-384．5C7+1176．2C9+198．9D9+228．0FF+228．3FR+131 243AR-426．8，

Y惠州=752．2D5-350．9C7+2159．6C9+582．3D9+226．6FF+233．1FR+125 553AR-429．7，

Y伯方島=825．4D5-686．8C7+1926．6C9+378．7D9+198．2FF+242．2FR+147 400AR-463．9，

Y橫須賀=654．5D5-572．9C7+1688．4C9+310．6D9+182．3FF+224．6FR+130 544AR-388．7，其中D5、C7、C9、D9表示橢圓傅里葉變量，D5即為第5個傅里葉諧值的D形態(tài)變量．

表3 褐菖鲉群體判別分析結果Tab.3 Discriminant result of S．marmoratus

圖1顯示，中國?？诤突葜萑后w主要分布于左上部，日本伯方島和橫須賀群體主要分布于右下部．

2.3 聚類分析結果

構建聚類關系樹能夠直觀地顯示各群體間差異．對4個褐菖鲉群體的85個耳石分析指標的平均值進行聚類分析，結果顯示，伯方島群體和橫須賀群體的平方Euclidean距離系數為0.001，?？谌后w與惠州群體的平方Euclidean距離系數為0.001，中國、日本群體聚類的平方Euclidean距離系數為0.003．根據距離系數構建聚類關系樹更直觀地顯示日本伯方島群體和橫須賀群體聚為一支，中國海口群體和惠州群體聚為另一支 (見圖2)．圖3顯示褐菖鲉4個群體個體間相互混雜，呈隨機分布狀態(tài)．

圖1 基于前兩個判別函數值的散點圖Fig.1 Scatter plot based on the first two discriminant functions

圖2 基于平方歐式距離的褐菖鲉群體聚類關系樹Fig.2 Dendrogram showing the relationship of S.marmoratus based on Euclidean square distance

圖3 褐菖鲉群體第一第二主成分散點圖Fig.3 Scatter plots of scores based on the first two principal components of S.marmoratus populations

2.4 主成分分析結果

對4個褐菖鲉群體的85個耳石分析指標進行主成分分析，結果顯示特征值大于1的主成分為17個，前17個主成分累積貢獻率為96.25%，其中第1主成分貢獻率為14.02%，第2主成分貢獻率為11.54%，第3主成分貢獻率為10.47%(見表4)．

表4 前17個主成分的特征值及貢獻率Tab.4 Eigenvalues and contributions of the first seventeen principle components

3 討論

3.1 多元統計分析結果

對中國、日本4個群體101尾褐菖鲉個體的85個耳石形態(tài)指標進行多元統計分析，判別分析結果顯示4個群體判別正確率在79.2%～100.0%之間，其中惠州群體判別正確率為100.0%，綜合判別正確率為89.1%(見表3);散點圖顯示中國海口和惠州群體聚為一團，分布于散點圖左上部，日本伯方島和橫須賀群體分布于右下部 (見圖1);聚類分析結果與判別分析結果一致，顯示日本伯方島群體和橫須賀群體聚為一支，中國?？谌后w和惠州群體聚為一支 (見圖2);主成分分析結果顯示前17個主成分解釋了96.25%的耳石形態(tài)差異 (見表4)．多元統計分析結果表明中國、日本褐菖鲉群體在耳石形態(tài)上存在較大差異，這與徐勝勇等[23]對中國、日本褐菖鲉群體形態(tài)學研究的結果相一致．魚類的生存環(huán)境如不同溫度、鹽度或營養(yǎng)條件等因素在一定程度上對魚類耳石有影響[3－5]．褐菖鲉為近岸巖礁性魚類[15－16]，生存環(huán)境對其形態(tài)特征影響較大．中國?？诤突葜萑后w位于25°N以南，日本橫須賀和伯方島群體位于30°N以北，水溫、營養(yǎng)條件等環(huán)境因素差異較大，可能導致中國、日本褐菖鲉群體在耳石形態(tài)上的差異．

對中國、日本4個褐菖鲉群體進行多元統計分析、判別分析和聚類分析結果顯示，中國、日本褐菖鲉在耳石形態(tài)上存在顯著差異 (見表3，圖1、圖2)，但主成分分析散點圖顯示4個褐菖鲉群體差異不顯著 (見圖3)．學者研究[24－25]發(fā)現，雖然主成分分析方法在“降維”過程中較其他方法 (例如通過改變統計假設人工篩選參數)效果好，但同樣會造成耳石信息的缺失．這可能是造成主成分分析散點圖結果與判別分析和聚類分析結果不一致的原因．

3.2 兩種鲉科魚類耳石形態(tài)學研究

對中國、日本4個褐菖鲉群體耳石形態(tài)進行多元統計分析的結果顯示，中國、日本褐菖鲉耳石形態(tài)存在顯著差異．徐勝勇等[26]對中國近海許氏平鲉不同地理群體間耳石形態(tài)進行分析，結果顯示8個許氏平鲉群體間耳石形態(tài)差異不顯著．許氏平鲉群體耳石形態(tài)學研究中，8個地理群體均位于黃海海域，由于海流的運輸作用，各地理群體附近海水溫度、鹽度等環(huán)境因素差異不大，可能是造成許氏平鲉群體間耳石形態(tài)差異不顯著的原因．褐菖鲉與許氏平鲉同為近岸巖礁性魚類，補充黃渤海和東海褐菖鲉群體樣品進一步分析，可能會發(fā)現褐菖鲉耳石形態(tài)隨緯度升高而變化的規(guī)律．對褐菖鲉群體耳石形態(tài)學研究還需增加群體數量，進行更深入的研究．

3.3 耳石形態(tài)學在褐菖鲉群體分析中的有效性

近年來，學者多將橢圓傅里葉分析方法與形狀指標法結合使用以增加種內與種間鑒別的準確性，例如Burke等[27]利用兩種分析方法，對大西洋鯡魚進行群體鑒別，正確率高達95%;王英俊等[28]對細條天竺鯛和黑鰓天竺鯛進行了分析，正確率分別為82%和88%．本研究對褐菖鲉耳石的8個形狀指標和77個橢圓傅里葉參數進行多元統計分析，綜合判別正確率高達89.1%，表明橢圓傅里葉分析方法與形狀指標法的結合應用能夠有效地進行褐菖鲉群體耳石形態(tài)學分析．魚類耳石形態(tài)分析方法在物種鑒別和群體分析研究方面有重要的應用價值，該研究豐富了耳石形態(tài)分析方法在種內群體分析方面的應用，同時也為褐菖鲉的群體遺傳學研究提供了輔助資料．

[1]L'ABEE －LUND J H．Otolith shape discriminates between juvenile Atlantic salmon，Salmo salar L.，and brown trout，Salmo trutta L. [J]．Journal of Fish Biology，1988，33:899-903．

[2]王英俊，葉振江，張弛，等．中國海域習見石斑魚屬魚類矢耳石形態(tài)特征 [J]．中國海洋大學學報，2011，41(1/2):55-60．

[3]CAMPANA S E，CASSELMAN J M．Stock discrimination using otolith shape analysis[J]．Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，1993，50:1062-1083．

[4]FEY D P．Differences in temperature conditions and somatic growth rate of larval and early juvenile spring-spawned herring from the Vistula Lagoon，Baltic Sea manifested in the otolith to fish size relationship[J]．Journal of Fish Biology，2001，58:1257-1273．

[5]STRANSKY C．Geographic variation of golden redfish(Sebastes marinus)and deep-sea redfish(S．mentella)in the North Atlantic based on otolith shape analysis[J]．ICES Journal of Marine Science，2005，62:1691-1698．

[6]STRANSKY C，MURTA A G，SCHLICKEISEN J，et al．Otolith shape analysis as a tool for stock separation of horse mackerel(Trachurus trachurus)in the Northeast Atlantic and Mediterranean[J]．Fisheries Research，2008，89:159-166．

[7]BURKE N，BROPHY D，KING P A．Otolith shape analysis:its application for discriminating between stocks of Irish Sea and Celtic Sea herring(Clupea harengus)in the Irish Sea[J]．ICES Journal of Marine Science，2008，65:1670-1675．

[8]CARDINALE M，DOERING-ARJES P，KASTOWSKY M，et al．Effects of sex，stock，and environment on the shape of known-age Atlantic cod(Gadus morhua)otoliths[J]．Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，2004，61(2):158-167．

[9]鄭文蓮．中國鲹科等魚類耳石形態(tài)的比較研究[C]//中國魚類學會．魚類學論文集:第二輯．北京:科學出版社，1981:39-54．

[10]羅秉征，盧繼武，黃頌芳．中國近海帶魚耳石生長的地理變異與地理種群的初步探討[C]//中國海洋湖沼學會．海洋與湖沼論文集．北京:科學出版社，1981:181-194．

[11]潘曉哲，高天翔．基于耳石形態(tài)的鱚屬魚類鑒別[J]．動物分類學報，2010，35(4):799-805．

[12]葉振江，孟曉夢，高天翔，等．兩種花鱸(Lateolabrax sp．)耳石形態(tài)的地理變異 [J]．海洋與湖沼，2007，38(4):356-360．

[13]葉振江，張弛，王英俊，等．中國天竺鯛屬魚類的矢耳石形態(tài)特征 [J]．海洋學報，2010，32(5):87-92．

[14]WANG Y J，YE Z J，LIU Q，et al．Stock discrimination of spottedtail goby(Synechogobius ommaturus)in the Yellow Sea by analysis of otolith shape[J]．Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，29(1):192-198．

[15]許明海．褐菖鲉漁業(yè)生物學初步研究[J]．漁業(yè)科學，1999(4):159-162．

[16]吳常文．浙江舟山近海褐菖鲉S．marmoratus生物學研究 [J]．浙江海洋學院學報，1999，18(3):185-191．

[17]王志錚，吳常文，侯偉芬，等．褐菖鲉仔稚魚生長特性及其關鍵變態(tài)期的研究[J]．海洋科學，2002，26(5):1-4．

[18]TUSET V M，LOZANO I J，GONZALEZ J A，et al．Shape indices to identify regional differences in otolith morphology of comber，Serranus cabrilla(L．，1758)[J]．Journal of Applied Ichthyology，2003，19(2):88-93．

[19]TUSET V M，ROSIN P L，ANTONIO L．Sagittal otolith shape used in the identification of fishes of the genus Serranus[J]．Fisheries Research，2006，81(2/3):316-325．

[20]侯剛，馮波，顏云榕，等．北部灣金線魚、深水金線魚與日本金線魚矢耳石形態(tài)識別的初步研究 [J]．中國海洋大學學報，2012，42(3):27-35．

[21]KUHL F，GIARDINA C．Elliptic Fourier features of a closed contour[J]．Computer Graphics and Image Processing，1982，18:236-258．

[22]IWATA H Y，UKAI．A computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors[J]．Journal of Heredity，2002，93:384-385．

[23]徐勝勇，張輝，柳本卓，等．中日褐菖鲉群體形態(tài)學比較研究 [J]．水生生物學報，2013，37(5):960-966．

[24]竇碩增，于鑫，曹亮．魚類矢耳石形態(tài)分析及其在群體識別中的應用實例研究[J]．海洋與湖沼，2012，43(4):702-712．

[25]DEVRIES D A，GRIMES C B，PRAGER M H．Using otolith shape analysis to distinguish eastern Gulf of Mexico and Atlantic Ocean stocks of king mackerel[J]．Fisheries Research，2002，57:51-62．

[26]徐勝勇，張輝，潘曉哲，等．許氏平鲉群體耳石形態(tài)學比較[J]．中國海洋大學學報，2012，42(11):54-61．

[27]BURKE N D，BROPHY P A．Shape analysis of otolith annuli in Atlantic herring(Clupea harengus):a new method for tracking fish populations[J]．Fisheries Research，2008，91(2/3):133-143．

[28]王英俊，葉振江，劉群，等．細條天竺魚與黑鰓天竺魚耳石形態(tài)識別的初步研究 [J]．海洋與湖沼，2010，41(2):282-285．