馬芮萍，朱艷冰，倪 輝，肖安風，蔡慧農(nóng)

(集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021)

0 引言

瓊脂主要是從海洋紅藻中提取出來的一種細胞間多糖，由瓊脂糖和硫瓊膠組成．瓊脂糖是不含有硫酸酯鹽的非離子型多糖，由D－半乳糖和3，6－內(nèi)醚－α－L－半乳糖以α－1，3糖苷鍵和β－1，4糖苷鍵交替連接形成的線性分子，是形成凝膠的組分;硫瓊膠結(jié)構(gòu)較復雜，具有和瓊脂糖相似的基本二糖重復單位，但帶有硫酸酯、甲氧基、葡萄糖醛酸和丙酮醛酸等基團，是非凝膠組分[1]．瓊膠酶可催化水解瓊脂糖分子內(nèi)的糖苷鍵，根據(jù)其作用于瓊脂糖的方式分為兩大類:α－瓊膠酶(E．C．3．2．1．158)和β－瓊膠酶(E．C．3．2．1．81)，前者可切斷瓊脂糖的α－1，3糖苷鍵生成瓊寡糖，如瓊二糖、瓊四糖及瓊六糖，后者切斷瓊脂糖的β－1，4糖苷鍵，作用產(chǎn)物為新瓊寡糖[1]．瓊膠酶水解瓊脂形成的瓊脂低聚糖具有減緩淀粉水解、抗氧化、抑制脂質(zhì)過氧化及保濕等功能，廣泛用于食品、化妝品及制藥工業(yè)等領(lǐng)域[1]．除可用于瓊脂低聚糖的制備，瓊膠酶也是生物研究領(lǐng)域的重要工具酶，用于分離制備海藻原生質(zhì)體，從海藻中提取不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素及甜菜堿等生物活性物質(zhì)[2]．因此，瓊膠酶及其產(chǎn)酶菌株是近年來海洋生物資源開發(fā)利用的熱點，具有重要的應用價值．

微生物來源的瓊膠酶產(chǎn)生菌主要是從海水、海洋沉積物、海洋軟體動物、淡水、土壤及海藻中發(fā)現(xiàn)的，包括假單孢菌屬 (Pseudomonas sp．)[3]、纖維菌屬 (Cellvibrio sp．)[4]、噬瓊膠菌屬(Agarivorans sp．)[5]、不動桿菌屬 (Acinetobacter sp．)[6]、紅球菌屬 (Rhodococcus sp．)[7]、噬細胞菌屬 (Cytophaga sp．)[8]、弧菌屬 (Vibrio sp．)[9]、假交替單孢菌屬 (Alteromonas sp．)[10]、微球菌屬 (Micrococcus sp．)[11]、桃色桿菌屬 (Persicobacter sp．)[12]、鹽桿菌屬 (Salegentibacter sp．)[13]和紫色桿菌屬(Janthinobacterium sp．)[14]等．目前，還未見寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas sp．)細菌產(chǎn)瓊膠酶的研究報道．本文嘗試從廈門紅樹林泥土樣品中分離出寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas sp．)海洋細菌，探討了該菌株產(chǎn)瓊膠酶的最適培養(yǎng)基組成和最佳產(chǎn)酶溫度．

1 材料和方法

1.1 材料

泥土樣品于2012年10月采自廈門集美紅樹林．

1)選擇培養(yǎng)基:瓊脂20 g，NaNO35 g，豆餅粉0.5 g，MgCl·6H2O 0.02 g，K2HPO40.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，過濾海水1000 mL，pH=7.5．

2)液體種子培養(yǎng)基:細菌學蛋白胨1 g，酵母浸膏0.5 g，KNO35 g，NaCl 30 g，MgSO4·7H2O 5 g，無水CaCl20.2 g，K2HPO40.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.5．

3)搖瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:瓊脂2 g，KNO35 g，NaCl 30 g，MgSO4·7H2O 5 g，無水CaCl20.2 g，K2HPO40.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，蒸餾水 1000 mL，pH=7.5．

1.2 主要試劑和儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Taq酶均購于廣州東盛生物科技有限公司，其他試劑均為市售分析純．

WFJ型可見分光光度計 (尤尼柯儀器有限公司);YXQ－LS－30SH立式壓力蒸汽滅菌器 (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國華電器有限公司);PCR儀 (美國BIORAD公司);5417R高速冷凍離心機 (德國Eppendorf公司)．

1.3 方法

1)產(chǎn)瓊膠酶細菌的分離 稱取適量泥土樣品，用無菌過濾海水進行10倍梯度稀釋．取稀釋后的泥土樣品200 μL，分別涂布于選擇培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)5 d．選取菌落周圍具有明顯水解圈或凹陷的菌株進行3次以上劃線純化培養(yǎng)，根據(jù)菌落的凹陷程度和菌落周圍的透明圈，選取產(chǎn)瓊膠酶能力最強的菌株 (命名為NTa)進行下一步研究．

2)16S rRNA基因的PCR擴增、序列測定以及同源性分析 利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并以此為模板采用16S rRNA基因的通用引物27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和1492R(5'－GGCTA CCTTGTTACGACTT－3')進行PCR擴增．反應條件為:95℃5 min;94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30個循環(huán);72℃ 10 min．PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京六合華大基因科技股份有限公司測序．所得16S rRNA基因序列通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行相似性比對，運用MEGA 4.0的Neighbor－Joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

3)生理生化鑒定 菌株的生長溫度、革蘭氏染色、芽孢染色、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗和卵磷脂酶實驗參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]．

4)瓊膠酶粗酶樣品制備 將菌株NTa種子液接種于搖瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃下180 r/min培養(yǎng)36 h后，發(fā)酵液于4℃、12000 r/min離心10 min，取上清液即為發(fā)酵粗酶液．

5)生物量的測定 取發(fā)酵液1 mL，12000 r/min離心10 min，傾去上清液，補充蒸餾水至3 mL，混合均勻后以蒸餾水作空白對照，在600 nm處測定吸光度值，檢測微生物的生物量．

6)瓊膠酶活力的測定 取50 μL粗酶液加入450 μL含0.5%瓊脂 (質(zhì)量分數(shù))的50 mmol/L NaH2PO4－Na2HPO4緩沖液 (pH=7.0)中，40℃水浴反應10 min，加入500 μL DNS溶液，置于沸水浴中5 min，冷卻后，用蒸餾水定容至5 mL，充分混勻后，于540 nm處測定吸光度值．以滅活的酶液作對照．在此條件下，每分鐘釋放1 μmoL還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位 (U)．

7)總糖的測定 發(fā)酵液稀釋10倍后，吸取1 mL于試管中，加入2 mL蒽酮試劑，沸水浴反應10 min，冷卻后，室溫放置10 min，在620 nm處測定吸光度值．

8)不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分不變，分別以0.2%(m/V)瓊脂、江蘺、海藻酸鈉、巖藻多糖、葡萄糖和麥芽糖為唯一碳源配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)后測定生物量及發(fā)酵液瓊膠酶活力，試驗不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響．

9)混合碳源對菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分不變，添加0.2%(m/V)的瓊脂后，再分別添加0.2%(m/V)葡萄糖、麥芽糖、海藻酸鈉和巖藻多糖作為額外碳源配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)后測定生物量及發(fā)酵液瓊膠酶活力，試驗額外添加的不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響．

10)不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他成分不變，保持氮元素含量為0.07%(m/V)，分別以硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨、蛋白胨和酵母浸膏為唯一氮源配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)后測定生物量及發(fā)酵液瓊膠酶活力，試驗不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響．

11)NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量分數(shù)(m/V)分別為1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%和6.0%，培養(yǎng)后測定生物量、發(fā)酵液瓊膠酶活力及總糖含量，試驗NaCl的質(zhì)量分數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響．

12)培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)溫度分別為19℃、22℃、25℃、28℃和31℃，培養(yǎng)后測定生物量、發(fā)酵液瓊膠酶活力及總糖含量，試驗溫度對菌株產(chǎn)酶的影響．

13)Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律分析 將菌種接入優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，并按照優(yōu)化后的條件進行培養(yǎng)，每隔8 h取發(fā)酵液測定生物量、瓊膠酶活力及總糖含量，試驗菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律．

14)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)為3次平行試驗的平均值，應用Excel軟件計算平均值和標準偏差，SPSS17.0軟件 (SPSS Inc.H，Chicago，IL)對結(jié)果進行差異顯著性分析(P〈0.05)．

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)瓊膠酶菌株的分離

NTa在瓊脂平板上可觀察到菌落周圍有非常明顯的凹陷，該菌株在平板上形成規(guī)則的圓形菌落，表面光滑濕潤，邊緣整齊，呈乳白色．

2.2 菌株的鑒定

以提取的菌株NTa的基因組DNA為模板、27F和1492R為引物進行PCR擴增，在大約1500 bp處得到單一、明亮的條帶 (見圖1)．目的基因進行測序，得到1451個堿基序列，將序列提交到GenBank獲得登錄號為KF516076．利用BLAST程序?qū)⑺?6S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)菌株NTa的16S rRNA基因序列與寡養(yǎng)單胞菌屬其他菌株的序列相似度在96%以上．一般認為，16S rRNA基因序列相似度大于95%時，可初步判定屬于同一個屬[16]．選取一些相似性較高的序列，通過MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(見圖2)顯示，菌株NTa位于寡養(yǎng)單胞菌屬的分枝下，與 Stenotrophomonas sp.2325(JX174202.1)和Stenotrophomonas malltophilia G46(JF783988)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，其序列相似度達到99.86%和99.72%．

圖1 16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of 16S rRNA gene

圖2 菌株NTa 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree derived from 16S rRNA gene sequence of strain NTa

菌株NTa為革蘭氏陰性，無芽孢，菌體呈直桿狀．菌株的部分生理生化鑒定結(jié)果顯示，明膠液化陰性，硝酸鹽還原陽性，卵磷脂酶陰性，利用葡萄糖和麥芽糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可在19～40℃生長，最適生長溫度為25℃．根據(jù)菌株的典型生理生化特征及16S rRNA基因系統(tǒng)進化分析，將菌株NTa鑒定為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)．

2.3 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

在無碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中按0.2%(m/V)的比例分別加入6種碳源，發(fā)酵后測定生物量及瓊膠酶活力，結(jié)果如圖3a所示．由圖3a可見，Stenotrophomonas sp.NTa在以瓊脂和江蘺作為唯一碳源時生長良好，酶活力分別為1.44 U/mL和1.25 U/mL，產(chǎn)酶量前者是后者的1.15倍．當以海藻酸鈉、巖藻多糖、葡萄糖和麥芽糖為唯一碳源時菌株可以生長，但是產(chǎn)酶能力弱．這些結(jié)果表明，瓊脂和江蘺都可以誘導菌株產(chǎn)瓊膠酶，瓊膠降解菌Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的最佳碳源是瓊脂．此外，其他碳源也可微弱誘導菌株產(chǎn)瓊膠酶．

2.4 混合碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

從圖3b中可以看出，添加質(zhì)量分數(shù)0.2%瓊脂時，同時分別添加質(zhì)量分數(shù)為0.2%的葡萄糖、麥芽糖、海藻酸鈉和巖藻多糖，瓊膠酶活力降低．額外添加葡萄糖和麥芽糖時，菌株生長旺盛，是以瓊脂為唯一碳源時的1.29倍，但是酶活力降低了10.80%．添加海藻酸鈉時菌株生長良好，但酶活力降低了12.89%．添加巖藻多糖后菌株基本不產(chǎn)瓊膠酶．綜上所述，菌株Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶時不需要額外添加碳源，在后續(xù)研究中以瓊脂為唯一碳源進行培養(yǎng)．

圖3 不同碳源對菌株NTa產(chǎn)瓊膠酶及菌體生長的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on agarase production and microorganism growth for the fermentation of Stenotrophomonas sp.NTa

2.5 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

本文比較了常規(guī)氮源對Stenotrophomonas sp.NTa產(chǎn)瓊膠酶的影響，結(jié)果如圖4所示．研究發(fā)現(xiàn)，在以酵母浸膏作為氮源時，菌株的生物量和產(chǎn)酶能力均達到最大，瓊膠酶活力達到1.45 U/mL，其次是KNO3，瓊膠酶活力達到1.44 U/mL，但是生物量明顯低于以酵母浸膏作為氮源時．當以 (NH4)2SO4和NH4NO3作為氮源時，菌株僅可微弱生長，但是基本不產(chǎn)瓊膠酶．因此，選取酵母浸膏為菌株Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的最佳氮源．

圖4 氮源對菌株NTa產(chǎn)瓊膠酶及菌體生長的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on agarase production and the growth of Stenotrophomonas sp.NTa

2.6 NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株產(chǎn)酶的影響

菌株 Stenotrophomonas sp.NTa來源于海洋，受NaCl影響較大．NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株產(chǎn)瓊膠酶的影響結(jié)果 (見表1)表明，在低質(zhì)量分數(shù)NaCl條件下，不利于菌株產(chǎn)酶．該菌株在NaCl質(zhì)量分數(shù)為3% ～6%時，表現(xiàn)出較高的產(chǎn)瓊膠酶能力．隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的增加，菌株的生物量和產(chǎn)酶能力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而總糖含量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢．當NaCl質(zhì)量分數(shù)為5%時，生物量和酶活力達到最大，分別為1.45 U/mL和1.74 U/mL．因此選用質(zhì)量分數(shù)為5%的NaCl作為最佳添加濃度．

2.7 溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

溫度對Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響結(jié)果 (見表2)顯示，在考察溫度范圍內(nèi)，菌株的生物量和產(chǎn)酶能力隨著溫度的升高均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而總糖含量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢．在28℃進行培養(yǎng)時，生物量和酶活力都達到最大值，分別為1.69 U/mL和1.86 U/mL，同時總糖含量降低了87.66%．

表1 NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株NTa產(chǎn)瓊膠酶及菌體生長的影響Tab.1 Effect of NaCl concentration on agarase production and the growth of Stenotrophomonas sp．NTa

表2 溫度對菌株NTa產(chǎn)瓊膠酶及菌體生長的影響Tab.2 Effect of temperature on agarase production and microorganism growth fermented by Stenotrophomonas sp．NTa

2.8 Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律分析

對液態(tài)發(fā)酵瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律進行分析，結(jié)果如圖5所示．在0～8 h內(nèi)，菌株生長處于延滯期，產(chǎn)酶能力微弱．在8～16 h內(nèi)，菌株迅速生長，產(chǎn)酶能力依舊微弱．在16～32 h內(nèi)，菌株的生物量繼續(xù)增大，瓊膠酶活力迅速升高．到40 h時，菌株的生物量達到最大，產(chǎn)酶能力最強，瓊膠酶活力達到1.98 U/mL．培養(yǎng)基的總糖含量在0～32 h內(nèi)持續(xù)下降，在32 h后趨于穩(wěn)定．

圖5 Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律分析Fig.5 Dynamic process of the agarase production by Stenotrophomonas sp.NTa during fermentation

3 討論

本文利用選擇性培養(yǎng)基從廈門紅樹林泥土樣品中分離得到能降解瓊脂的海洋細菌NTa，根據(jù)菌株的16S rRNA基因序列分析及典型生理生化特性分析，將NTa歸屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas sp．)．該屬是1993年分離出來的一個新屬，屬于黃單胞菌目 (Xanthomonadales)，黃單胞菌綱 (Xanthomonadaceae)，目前尚未見該菌屬相關(guān)瓊膠酶活力及產(chǎn)酶條件的報道．因此，寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas sp．)是開發(fā)瓊膠酶的另一類菌種來源．

在選擇碳源的實驗中發(fā)現(xiàn)，Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的最佳碳源是瓊脂，以其為唯一碳源時產(chǎn)酶活力最高．同時，其他碳源也可微弱誘導菌株產(chǎn)瓊膠酶．此研究結(jié)果與Lakshmikanth等[3]的研究結(jié)果不同，Pseudomonas aeruginosa AG LSL－11只有以瓊膠為碳源時才可誘導其分泌瓊膠酶．發(fā)酵培養(yǎng)基中同時存在瓊脂和葡萄糖時，菌株NTa生長旺盛，但產(chǎn)酶能力降低．Vander Meulen等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，當將瓊膠與葡萄糖混合作為碳源時，瓊膠酶的產(chǎn)量顯著下降為瓊膠單獨誘導產(chǎn)酶量的20%，表明，當培養(yǎng)基中額外添加葡萄糖時，瓊膠酶受到分解代謝物阻遏．瓊脂與其他多糖混合作為碳源可完全抑制Pseudomonas aeruginosa AG LSL－11分泌瓊膠酶[3]，但可以增強Acinetobacter sp.AG LSL－1分泌瓊膠酶的能力[6]．

氮源是影響微生物生長代謝的重要因素，本研究中采用酵母浸膏為氮源發(fā)酵菌株NTa時菌體的生物量及瓊膠酶的產(chǎn)量明顯高于其他氮源，酵母浸膏富含完全蛋白質(zhì)、均衡的必需氨基酸及核苷酸，有利于Stenotrophomonas sp.NTa的吸收利用，促進其生長及分泌瓊膠酶．蛋白胨含有大量的氨基酸及小肽，有利于微生物的吸收利用．Alexeeva研究表明，必須添加蛋白胨以保證微生物產(chǎn)糖酶[17]．但對Stenotrophomonas sp.NTa的生長和產(chǎn)瓊膠酶，蛋白胨不是合適的氮源，添加蛋白胨不利于微生物產(chǎn)瓊膠酶．本研究中采用無機氮源(NH4)2SO4和NH4NO3時菌株僅可微弱生長，但是基本不產(chǎn)瓊膠酶，可能是由于銨根離子存在時不利于菌株生長和產(chǎn)瓊膠酶．微生物的種類不同，利于產(chǎn)酶的最適氮源也有所不同．Vander Meulen等的研究發(fā)現(xiàn)，Cytophaga flevvensis生長優(yōu)先利用銨態(tài)氮，其分泌瓊膠酶的最佳氮源為NH4NO3[8]．王靜雪等報道，檸檬酸三銨是海洋弧菌QJH－12產(chǎn)瓊膠酶的最佳氮源[9]．

海洋微生物是瓊膠酶重要來源，因此NaCl對菌體產(chǎn)酶具有重要作用．發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl的質(zhì)量分數(shù)為5%時，Stenotrophomonas sp.NTa生長茂盛，產(chǎn)酶能力最高．海洋弧菌QJH－12發(fā)酵產(chǎn)酶時的最適NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%[9]，Tamlana sp.MA－B22發(fā)酵產(chǎn)酶的最適NaCl質(zhì)量分數(shù)為2.5%[18]．

培養(yǎng)溫度對微生物產(chǎn)酶具有重要影響，本研究中28℃是Stenotrophomonas sp.NTa生長和產(chǎn)酶的最佳溫度，而Cytophaga flevvensis產(chǎn)瓊膠酶的最適培養(yǎng)溫度為20℃[8]，Pseudomonas aeruginosa AG LSL－11的為30 ℃[3]，Tamlana sp.MA－B22的為25 ℃[18]，Acinetobacter sp.AG LSL－1分泌瓊膠酶的最適溫度為37 ℃[6]．

在優(yōu)化后的最適條件下發(fā)酵40 h后，Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵液的酶活力達到1.98 U/mL．Pseudomonas aeruginosa AG LSL－11的瓊膠酶最大產(chǎn)量為0.32 U/mL[3]，Acinetobacter sp.AG LSL －1的瓊膠酶最大產(chǎn)量為 0.45 U/mL[6]，Agarivorans albus YKW －34的瓊膠酶最大產(chǎn)量為 0.87 U/mL[5]，Vibrio sp.QJH－12的瓊膠酶最大產(chǎn)量為1.84 U/mL[9]．菌株Stenotrophomonas sp.NTa的產(chǎn)酶能力具有一定的優(yōu)勢，為進一步開發(fā)海洋瓊膠酶資源提供了基礎(chǔ)材料．

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