曾 晨，李元躍，陳融斌，潘 文，蔡麗欽，陳國貴，黎中寶

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021;2.福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021;3.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

鄰苯二甲酸酯類化合物 (Phthalate esters，PAEs)作為主要的增塑劑和軟化劑，世界年產(chǎn)量在2 Mt以上[1]，在環(huán)境中廣泛存在[2]，已被美、日、中多國列為重點(diǎn)控制的環(huán)境污染物[3].鄰苯二甲酸二丁酯 (Dibutylphthalate，DBP)是PAEs中比較常見的一種[4]，可通過呼吸、皮膚接觸和食物鏈等途徑進(jìn)入人體，從而對人類健康造成潛在的危害，有學(xué)者描述其為產(chǎn)量最大的人類制造的環(huán)境污染物之一[4-5].美國國家環(huán)保局和中國環(huán)境檢測總站均將該化合物列為環(huán)境優(yōu)先控制污染物[6-8].目前有關(guān)DBP毒性效應(yīng)的研究大多集中在對動物的毒性損傷，對浮游植物[9]、浮游動物[10]的毒性作用以及藻類的相互作用[11]等方面，而對高等植物包括對紅樹植物影響的研究未見報(bào)道.

紅樹林是熱帶亞熱帶海岸潮間帶木本植物，作為初級生產(chǎn)者為海區(qū)和陸緣生物提供食物來源，也為鳥類、昆蟲、魚蝦貝類、藻菌等提供棲息繁衍場所，并構(gòu)成復(fù)雜的食物鏈和食物網(wǎng)關(guān)系，具有重大的社會、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益.我國紅樹林資源主要分布在沿海的浙江、福建、廣東、海南、廣西、臺灣等，秋茄(Kandelia candel)是其中耐寒性最強(qiáng)的紅樹植物，自然分布緯度最高最廣，有紅樹林的地方均有秋茄林，是我國的廣布種，也是我國東南沿海紅樹林生態(tài)恢復(fù)工程中重要的紅樹品種[12-14].本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下，利用不同質(zhì)量濃度的增塑劑DBP培育紅樹植物秋茄幼苗，研究秋茄幼苗對不同濃度增塑劑DBP的生理生態(tài)效應(yīng)，以期揭示并科學(xué)地預(yù)測、評價(jià)增塑劑DBP對紅樹植物的生理生態(tài)影響，為紅樹林濕地的保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)得到更為全面的有關(guān)新型污染物DBP的生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù)，為DBP的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)和污染控制提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用紅樹植物秋茄為研究對象.成熟的秋茄種苗于2012年5月采自福建九龍江口紅樹林自然保護(hù)區(qū)南岸龍海浮宮鎮(zhèn)草埔頭村 (24°29'N，117°55'E)的秋茄林.挑選生活力強(qiáng)、無病蟲害且大小成熟度相近的種苗2000株 (平均長度(23.08±2.35)cm，平均鮮重(16.9±3.119)g)，于2012年5月12日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)栽培.6個(gè)月后，選擇第三對成熟葉片作為實(shí)驗(yàn)材料.

DBP母液配置:用質(zhì)量濃度為10 g/L的吐溫-80助溶，每周實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)稀釋.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

秋茄種苗分別栽培于塑料網(wǎng)框的砂基上，并套入大小相近的塑料盆中，每盆砂基高15 cm、直徑30 cm，每盆種植種苗10株，共計(jì)18盆.DBP 6個(gè)質(zhì)量濃度梯度 (CK、D1、D2、D3、D4、D5)分別設(shè)為0、0.02、0.20、2.00、5.00、10.00 mg/L，每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)平行，共計(jì)18盆.培養(yǎng)液用鹽度為15的海水和DBP標(biāo)準(zhǔn)液配制，每盆注入培養(yǎng)液3000 mL，每7 d重新更換培養(yǎng)液，每天用自來水補(bǔ)足散失的水分.

實(shí)驗(yàn)盆栽置于自然透光的溫室大棚中培養(yǎng)，培養(yǎng)期為180 d，溫室大棚白天平均最高氣溫為(29.96±3.57)℃，夜間最低氣溫為(23.43±3.58)℃.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

每組分別稱取0.1 g的葉片凍干粉末，加入pH值為7.8的0.05 mol/L的磷酸緩沖液，在冰浴中用勻漿器研磨成勻漿，4℃冰箱靜置后，在高速冷凍離心機(jī)上4℃9000 r/min離心30 min，取上清液冷藏保存用于酶活性的測定.

采用紫外分光光度法測定CAT的活性，以每分鐘內(nèi)OD240值變化0.1的酶量為1個(gè)酶活單位計(jì)算CAT的活性.

參考愈創(chuàng)木酚法測定POD的活性[17]，以每分鐘內(nèi)OD470變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位計(jì)算POD的活性.

采用氮藍(lán)四唑法測定SOD活力[17]，以抑制光華還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，計(jì)算SOD的活性.

葉綠素含量測定:參考陳福明等的混合液法[15].

MDA含量測定:參照劉祖祺和Aebi等方法測定[16].

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0，處理差異顯著性分析采用S-N-K法檢驗(yàn)比較 (顯著水平P=0.05)，圖表制作工具為Origin 8.0.

2 結(jié)果

2.1 DBP對秋茄幼苗葉綠素含量的影響

秋茄幼苗葉綠素含量和變化趨勢如圖1所示，隨著DBP質(zhì)量濃度的升高，秋茄幼苗葉片各葉綠素含量均呈現(xiàn)上升趨勢，且各組含量均極顯著高于對照組(P〈0.01)，D4組達(dá)到最大值.D1、D2、D3、D4和D5各組葉綠素a的質(zhì)量比分別高出對照組125.96%、126.58%、134.47%、164.00%、159.44%;葉綠素 b的質(zhì)量比分別高出對照組140.55%、132.77%、123.71%、171.30%、156.43%;總?cè)~綠素質(zhì)量比分別高出對照組129.52%、128.09%、131.83%、165.79%、158.69%.

圖1 DBP對秋茄幼苗葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of DBP stress on chlorophyll concentration in leaves of K.candel seedlings

2.2 DBP對秋茄幼苗葉片丙二醛含量的影響

秋茄幼苗丙二醛含量和變化趨勢如圖2a所示，隨著DBP質(zhì)量濃度的升高，MDA的濃度呈現(xiàn)梯度上升趨勢，二者呈極顯著正相關(guān).各處理濃度間存在顯著差異(P〈0.05)，處理組MDA濃度均高于對照組，D1、D2、D3、D4和D5各濃度組分別高出對照組19.73%、23.52%、34.11%、39.22%、44.62%.

2.3 DBP對秋茄幼苗葉片CAT、POD和SOD活性的影響

在如圖2b所示，隨著DBP濃度的升高，CAT的活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，處理組CAT活性均高于對照組.D2、D3、D4組同對照組之間存在極顯著差異(P〈0.01)，分別高出對照組119.82%、127.49%和215.82%;D1、D5組同對照組之間無顯著差異(P〉0.05).

如圖2c所示，隨著DBP濃度的升高，POD的活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，處理組POD活性除D5組外均高于對照組.D1組同對照組之間存在顯著差異(P〈0.05);D2、D3、D4組同對照組之間存在極顯著差異 (P〈0.01)，分別高出對照組43.51%、60.81%和87.62%;D5組同對照組之間無顯著差異(P〉0.05).

如圖2d所示，隨著DBP濃度的升高，SOD的活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，處理組CAT活性除D5組外均高于對照組.D2、D3、D4組同對照組之間存在極顯著差異(P〈0.01)，分別高出對照組9.86%、8.54%和6.92%;D1、D5組同對照組之間無顯著差異(P〉0.05).

圖2 DBP對秋茄幼苗抗氧酶活性的影響Fig.2 Effect of DBP stress on MDA concentration in leaves of K.candel seedlings

3 討論

3.1 DBP對秋茄幼苗葉片葉綠素含量的影響

植物光合作用是植物能量的主要來源，葉綠素a和葉綠素b是植物光合作用的主要色素和輔助色素，其含量的多少體現(xiàn)了植物光合作用的強(qiáng)度.當(dāng)植物受逆境脅迫時(shí)，植物葉片中葉綠素的含量會降低，但對于耐性較強(qiáng)的植物來說，葉綠素含量降低得比較緩慢或者在一定濃度范圍內(nèi)會升高[18].胡芹芹等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)斜生柵藻的葉綠素含量在DBP低濃度范圍內(nèi)增加，高濃度范圍內(nèi)降低.本研究中，各濃度組秋茄幼苗葉片中葉綠素含量均高于對照組，秋茄幼苗在受到DBP的脅迫時(shí)產(chǎn)生了抗逆性的反應(yīng)，增大葉綠素的含量來增強(qiáng)光合作用，從而增強(qiáng)植物細(xì)胞能量的來源，使植物能夠有效地對抗外界的脅迫從而正常的生長.本研究表明秋茄幼苗在所設(shè)DBP質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，仍然能保持相對正常的光合色素水平.

3.2 DBP對秋茄幼苗葉片丙二醛含量的影響

植物在逆境脅迫過程時(shí)會導(dǎo)致活性氧的積累，活性氧的積累就會引發(fā)或者加劇膜脂過氧化作用.MDA作為其產(chǎn)物之一，通常當(dāng)做脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜過氧化程度和植物對逆境反應(yīng)條件的強(qiáng)弱[20].楊盛昌等[21]研究表明，隨著培養(yǎng)液中Cd質(zhì)量濃度的增加，桐花樹葉片的膜脂過氧化作用則有明顯增強(qiáng);孫娟等[22]研究發(fā)現(xiàn)，隨著萘質(zhì)量濃度的提高，白骨壤幼苗葉片MDA含量變化基本呈先升后降的趨勢，且各處理組含量與對照組相當(dāng)或普遍高于對照組.本研究中，隨著DBP質(zhì)量濃度的增加，秋茄葉片的脂膜過氧化作用明顯增強(qiáng)，說明DBP導(dǎo)致了秋茄細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)膜過氧化作用，這與之前的研究[21-22]結(jié)果相一致.

3.3 DBP對秋茄幼苗葉片中保護(hù)酶的影響

CAT是植物體內(nèi)一種重要的氧化還原酶，可以清除植物通過呼吸代謝或者光合作用等途徑產(chǎn)生的H2O2，維持活性氧代謝的平衡，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[23].在本試驗(yàn)中CAT活性和POD活性的變化趨勢非常相似，其同樣也是在受到低濃度DBP脅迫時(shí)會增加自己的活性以清除植物體內(nèi)過多的H2O2并以此維系植物的正常生命活動，但，一旦DBP污染超過一定質(zhì)量濃度，植物體內(nèi)的H2O2太多超出了CAT能清除的范圍，DBP就會抑制CAT的進(jìn)一步增加，甚至對CAT酶體系產(chǎn)生毒害.

DBP脅迫能誘導(dǎo)植物組織中POD活性的升高，POD活性的增強(qiáng)能幫助植物清除由于金屬毒害產(chǎn)生的過氧化物和自由基[23].張鳳琴等[24]的研究表明，復(fù)合重金屬脅迫時(shí)秋茄幼苗POD的含量能迅速地提高從而減輕重金屬對植物的傷害，但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/L時(shí)，葉片和根系中的POD活性都有所下降.王詩嘉等[25]在研究鄰苯二甲酸二乙基己酯對蠶豆幼苗莖和葉POD活性的影響結(jié)果顯示，DEHP質(zhì)量濃度較低時(shí)，隨DEHP質(zhì)量濃度的升高，蠶豆幼苗莖、葉POD活性逐漸升高，當(dāng)DEHP質(zhì)量濃度較高時(shí)，POD活性又顯著降低.本實(shí)驗(yàn)中，在DBP質(zhì)量濃度在0～5 mg/L的濃度范圍內(nèi)POD活性是上升的，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L時(shí)就出現(xiàn)下降趨勢，這可能是高質(zhì)量濃度的DBP脅迫超過了植物體內(nèi)POD等保護(hù)酶的承受極限而破壞了植物細(xì)胞中的多種功能膜以及酶體系，從而導(dǎo)致POD活性降低.

在正常的生長環(huán)境下，植物體內(nèi)的機(jī)制能將活性氧自由基控制在較低的水平，當(dāng)植物受到外界的脅迫時(shí)，活性氧自由基的增加能促使SOD活性增加，進(jìn)而清除自由基，從而保護(hù)植物免受傷害.鄭文教等[26]研究表明，重金屬鉻脅迫對紅樹植物秋茄幼苗SOD活性的變化是隨著質(zhì)量濃度的增加呈先升后降的狀況.本試驗(yàn)中，當(dāng)DBP質(zhì)量濃度超過2 mg/L時(shí)，SOD活性就開始下降，到質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L時(shí)，SOD的活性已經(jīng)比對照組低.SOD活性先升高后下降符合植物對脅迫反應(yīng)的典型特征，當(dāng)受到脅迫后，植物會通過提高自身抗性以適應(yīng)外界的脅迫，但當(dāng)脅迫發(fā)生超承受閾值時(shí)，其防御逐漸減弱，甚至死亡.在高質(zhì)量濃度DBP的脅迫下，秋茄幼苗葉片中的SOD已經(jīng)無法清除過多的超氧陰離子自由基，同時(shí)SOD酶體系也一定程度地受到了高質(zhì)量濃度DBP的毒害，所以在高質(zhì)量濃度DBP的脅迫下，SOD酶活性比對照組低.

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