曹波+張琳琳+柴春香+趙學(xué)蘭+張培榮+陳學(xué)勛

[摘要] 目的 探討烏司他?。║TI）對盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）所致大鼠膿毒癥急性腎損傷（AKI）的保護(hù)作用。 方法 SD健康雄性大鼠55只，按隨機(jī)化原則分成3組：正常對照組5只、模型組25只、烏司他丁治療組25只，后兩組再隨機(jī)分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1h、6h、12h、24h、48h），每組每時(shí)間點(diǎn)各5只，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)復(fù)制膿毒癥模型，烏司他丁治療組，造模后立即給予烏司他丁10萬U/kg，尾靜脈注射，分別在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血、留尿標(biāo)本，進(jìn)行腎功能血肌酐（Scr）、尿素（Urea），尿腎損傷分子（KIM-1）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）檢測分析。 結(jié)果 與模型組相比，烏司他丁治療組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Scr、Urea，尿KIM-1、IL-18、NGAL濃度均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 烏司他丁對膿毒癥所致急性腎損傷具有一定的腎臟保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 烏司他?。荒摱景Y；急性腎損傷；尿相關(guān)指標(biāo)

[中圖分類號(hào)] R96 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）05-25-04

膿毒癥并發(fā)急性腎損傷（AKI）的發(fā)病率為19%～23%，當(dāng)膿毒癥并發(fā)急性腎損傷（AKI）時(shí)，不僅給有效干預(yù)手段帶來困難，增加患者死亡率，而且耗費(fèi)巨大的醫(yī)療資源和巨額醫(yī)療費(fèi)用，因此，及早防治膿毒癥并發(fā)急性腎損傷，保護(hù)腎功能意義重大[1]。烏司他丁（UTI）是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，具有清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)，抑制蛋白質(zhì)分解代謝亢進(jìn)，以及多種蛋白酶活性等藥理作用，對多臟器損傷有

保護(hù)作用[2-4]。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) （CLP）[5]建立膿毒癥大鼠AKI模型，觀察烏司他丁對膿毒癥所致AKI的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

注射用烏司他丁10萬U/支（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，H19990134）；腎損傷分子1（KIM-1） ELISA試劑盒（美國R&D公司）、白細(xì)胞介素18（IL-18） ELISA試劑盒（武漢博士德公司）和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 （NGAL） ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

SD健康雄性大鼠55只，清潔級，10～12周，體質(zhì)量200～250g，由濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)室提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)化原則分成3組：（1）正常對照組（n=5）：尾靜脈推注生理鹽水2mL；（2） 模型組（n=25）：行CLP；（3）烏司他丁治療組（n=25）：行CLP后即刻尾靜脈推烏司他丁10萬U/kg；模型組、烏司他丁治療組，再隨機(jī)分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、6、12、24、48h），每組每時(shí)間點(diǎn)各5只，術(shù)后均補(bǔ)充生理鹽水3mL/100g抗休克。

1.3 動(dòng)物模型制備

實(shí)驗(yàn)前禁食12h，手術(shù)組采用經(jīng)典的CLP復(fù)制膿毒癥AKI模型，即用10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔麻醉，無菌條件下沿腹中線切開長約2cm，分離、結(jié)扎盲腸，在盲端腸壁用12號(hào)針穿刺2次，留置1條長1cm寬2 mm、兩頭貫穿盲腸的橡皮片，擠出少許糞便，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁，編號(hào)，清醒后轉(zhuǎn)入代謝籠內(nèi)自由進(jìn)水、進(jìn)食。術(shù)畢補(bǔ)充生理鹽水3mL/100g，術(shù)后自由飲食水。

1.4 留取標(biāo)本

從術(shù)后腹壁縫合結(jié)束開始計(jì)時(shí)，分別于1、6、12、24、48h取材，下腔靜脈抽血5mL，離心（3000 r/min）15min，取血清于-20℃保存，待測Scr、BUN；膀胱分離，膀胱穿刺收集尿標(biāo)本于-20℃保存，待測KIM-1、IL-18、NGAL。

1.5 指標(biāo)檢測

采用Roche Cobas 8000全自動(dòng)生化免疫分析儀（德國Roche公司）測定Scr、Urea。尿液標(biāo)本均采用Thermo MK3（北京長弓科技有限公司）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法檢測KIM-1、IL-18和NGAL。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（）表示，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

模型組大鼠病態(tài)明顯，蜷縮，活動(dòng)減少，少食或拒食，呼吸明顯加快，反應(yīng)遲鈍，尿量減少等。與模型組相比，烏司他丁治療組大鼠一般情況病態(tài)表現(xiàn)較輕，但較正常對照組差。

2.2 大鼠腎功能的變化

CLP術(shù)后6h，兩組大鼠Scr、Urea的濃度開始升高，24h達(dá)高峰，48h開始下降，均顯著高于對照組（P<0.05）。烏司他丁治療組12、24、48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Scr、Urea均顯著低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；烏司他丁治療組大鼠48h時(shí)Scr、Urea的濃度明顯回落，但仍然高于對照組（P<0.05）。見表1～2。

2.3 兩組大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18含量的變化

CLP術(shù)后兩組大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24h，48h下降，均顯著高于對照組（P<0.05）。烏司他丁治療組6h，12h，24h，48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)尿KIM-1、NGAL、IL-18含量顯著低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；烏司他丁治療組大鼠48h時(shí)尿KIM-1、NGAL、IL-18含量回落顯著，但仍高于對照組（P<0.05）。見表3～5。

3 討論

膿毒癥時(shí)，腎臟的內(nèi)皮細(xì)胞不僅被激活，產(chǎn)生炎性因子，同時(shí)也是炎性因子首要攻擊的靶細(xì)胞之一[5-7]。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，膿毒癥一旦并發(fā)腎臟損害，治療難度明顯增加，而且耗費(fèi)巨大的醫(yī)療資源和巨額醫(yī)療費(fèi)用。因此，及早防治膿毒癥并發(fā)急性腎損傷，保護(hù)腎功能意義重大[8-9]。endprint

目前對急性腎損傷的檢測，傳統(tǒng)采用血清肌酐、尿素來評價(jià)，但該項(xiàng)指標(biāo)的變化，出現(xiàn)升高較晚，很多研究證實(shí)，在大鼠AKI模型建立后6h開始升高，24h才達(dá)到高峰，48h開始下降，與KIM-1相比要晚[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后6h，兩組大鼠Scr、Urea的濃度開始升高，24h達(dá)高峰，48h開始下降，與國內(nèi)外報(bào)道相似[7-10]。

KIM-1是一種新的I型跨膜蛋白，參與腎小管上皮組織形態(tài)和功能的恢復(fù)，但在AKI后呈現(xiàn)高水平表達(dá)，并可在尿中檢測出，在正常腎組織中表達(dá)微弱。國內(nèi)外曾有學(xué)者研究急性腎損傷大鼠模型的尿KIM-1水平在誘導(dǎo)后第一天時(shí)均較誘導(dǎo)前的基線水平有3～5倍的升高，明顯早于其他傳統(tǒng)檢測指標(biāo)的改變，可以作為急性腎衰竭患者不良臨床后果的預(yù)測指標(biāo)[8，10，11]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠CLP術(shù)后大鼠尿KIM-1于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24、48h下降，均顯著高于對照組，與相關(guān)報(bào)道類似[8，10，11]。

IL-18被認(rèn)為與膿毒癥時(shí)臟器功能受損關(guān)系密切，IL-18能促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因如Fasl的表達(dá)及降低抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮促凋亡作用，導(dǎo)致免疫功能紊亂，促進(jìn)臟器功能損傷。曾有研究顯示，在小鼠腎缺血性損傷模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解為成熟形式釋放入尿，并可在尿中被檢測出，目前經(jīng)常選用的評價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)程度和治療效果的指標(biāo)[2，7，10，12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后大鼠尿IL-18于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24h，48h下降，均顯著高于對照組，與相關(guān)報(bào)道相似[2，7，12]。表明膿毒癥大鼠急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展，可能與炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)。

NGAL是一種分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常腎組織中呈低水平表達(dá)，但在腎缺血/再灌注損傷和順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中，損傷后3h時(shí)的尿液中即可檢測到NGAL，明顯早于尿NAG、β2微球蛋白及Scr的改變，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2h時(shí)尿NGAL水平與AKI程度相關(guān)，是AKI獨(dú)立預(yù)測因子，也是目前基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常選用的評價(jià)急性腎功能損傷的指標(biāo)[2，4，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后大鼠尿NGAL、于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24、48h下降，均顯著高于對照組，與有報(bào)道升高提前[2，7，8，10]，可能與本實(shí)驗(yàn)在制作模型時(shí)大鼠的選擇，觀察時(shí)間分段不一有關(guān)。

烏司他?。║TI）是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜及細(xì)胞亞膜、穩(wěn)定溶酶體膜抑制溶酶體釋放、清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)，抑制蛋白質(zhì)分解代謝亢進(jìn)，以及多種蛋白酶活性等藥理作用，并對多臟器損傷有保護(hù)作用[2-4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏司他丁治療組12、24、48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Scr、Urea均顯著低；烏司他丁治療組6、12、24、48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)尿KIM-1、NGAL、IL-18含量顯著低，與國內(nèi)外報(bào)道相似[2-4，13-15]。烏司他丁可能因減輕中性粒細(xì)胞的局部浸潤，抑制炎癥介質(zhì)釋放等機(jī)制對急性腎損傷大鼠腎功能起到保護(hù)作用。

本研究通過CLP復(fù)制膿毒癥急性腎損傷模型，經(jīng)烏司他丁治療，顯示了很好的腎臟保護(hù)作用，可能通過清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放等機(jī)制，達(dá)到對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟起到保護(hù)作用。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-12-24）endprint

目前對急性腎損傷的檢測，傳統(tǒng)采用血清肌酐、尿素來評價(jià)，但該項(xiàng)指標(biāo)的變化，出現(xiàn)升高較晚，很多研究證實(shí)，在大鼠AKI模型建立后6h開始升高，24h才達(dá)到高峰，48h開始下降，與KIM-1相比要晚[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后6h，兩組大鼠Scr、Urea的濃度開始升高，24h達(dá)高峰，48h開始下降，與國內(nèi)外報(bào)道相似[7-10]。

KIM-1是一種新的I型跨膜蛋白，參與腎小管上皮組織形態(tài)和功能的恢復(fù)，但在AKI后呈現(xiàn)高水平表達(dá)，并可在尿中檢測出，在正常腎組織中表達(dá)微弱。國內(nèi)外曾有學(xué)者研究急性腎損傷大鼠模型的尿KIM-1水平在誘導(dǎo)后第一天時(shí)均較誘導(dǎo)前的基線水平有3～5倍的升高，明顯早于其他傳統(tǒng)檢測指標(biāo)的改變，可以作為急性腎衰竭患者不良臨床后果的預(yù)測指標(biāo)[8，10，11]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠CLP術(shù)后大鼠尿KIM-1于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24、48h下降，均顯著高于對照組，與相關(guān)報(bào)道類似[8，10，11]。

IL-18被認(rèn)為與膿毒癥時(shí)臟器功能受損關(guān)系密切，IL-18能促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因如Fasl的表達(dá)及降低抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮促凋亡作用，導(dǎo)致免疫功能紊亂，促進(jìn)臟器功能損傷。曾有研究顯示，在小鼠腎缺血性損傷模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解為成熟形式釋放入尿，并可在尿中被檢測出，目前經(jīng)常選用的評價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)程度和治療效果的指標(biāo)[2，7，10，12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后大鼠尿IL-18于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24h，48h下降，均顯著高于對照組，與相關(guān)報(bào)道相似[2，7，12]。表明膿毒癥大鼠急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展，可能與炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)。

NGAL是一種分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常腎組織中呈低水平表達(dá)，但在腎缺血/再灌注損傷和順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中，損傷后3h時(shí)的尿液中即可檢測到NGAL，明顯早于尿NAG、β2微球蛋白及Scr的改變，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2h時(shí)尿NGAL水平與AKI程度相關(guān)，是AKI獨(dú)立預(yù)測因子，也是目前基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常選用的評價(jià)急性腎功能損傷的指標(biāo)[2，4，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后大鼠尿NGAL、于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24、48h下降，均顯著高于對照組，與有報(bào)道升高提前[2，7，8，10]，可能與本實(shí)驗(yàn)在制作模型時(shí)大鼠的選擇，觀察時(shí)間分段不一有關(guān)。

烏司他?。║TI）是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜及細(xì)胞亞膜、穩(wěn)定溶酶體膜抑制溶酶體釋放、清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)，抑制蛋白質(zhì)分解代謝亢進(jìn)，以及多種蛋白酶活性等藥理作用，并對多臟器損傷有保護(hù)作用[2-4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏司他丁治療組12、24、48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Scr、Urea均顯著低；烏司他丁治療組6、12、24、48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)尿KIM-1、NGAL、IL-18含量顯著低，與國內(nèi)外報(bào)道相似[2-4，13-15]。烏司他丁可能因減輕中性粒細(xì)胞的局部浸潤，抑制炎癥介質(zhì)釋放等機(jī)制對急性腎損傷大鼠腎功能起到保護(hù)作用。

本研究通過CLP復(fù)制膿毒癥急性腎損傷模型，經(jīng)烏司他丁治療，顯示了很好的腎臟保護(hù)作用，可能通過清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放等機(jī)制，達(dá)到對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟起到保護(hù)作用。

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[10] 周芳芳，羅群，蘭凱.KIM-1、NGAL和IL-18聯(lián)合檢測在大鼠缺血再灌注急性腎損傷早期診斷中的意義[J].浙江醫(yī)學(xué)，2010，32（8）：1202-1204.

[11] Solling C，Christensen AT，Kraq S，et al.Erythropoitin administration is associated with short-term improvement in glomerular filtration rate after ischemia reperfusion injury[J].Acta Anaesthesiol Scand，2011，55（7）：185-195.

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[15] 應(yīng)斌宇，孫來芳，程碧環(huán)，等.烏司他丁對創(chuàng)傷弧菌膿毒血癥實(shí)驗(yàn)大鼠細(xì)胞因子的影響和意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（4）：362-364.

（收稿日期：2013-12-24）endprint

目前對急性腎損傷的檢測，傳統(tǒng)采用血清肌酐、尿素來評價(jià)，但該項(xiàng)指標(biāo)的變化，出現(xiàn)升高較晚，很多研究證實(shí)，在大鼠AKI模型建立后6h開始升高，24h才達(dá)到高峰，48h開始下降，與KIM-1相比要晚[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后6h，兩組大鼠Scr、Urea的濃度開始升高，24h達(dá)高峰，48h開始下降，與國內(nèi)外報(bào)道相似[7-10]。

KIM-1是一種新的I型跨膜蛋白，參與腎小管上皮組織形態(tài)和功能的恢復(fù)，但在AKI后呈現(xiàn)高水平表達(dá)，并可在尿中檢測出，在正常腎組織中表達(dá)微弱。國內(nèi)外曾有學(xué)者研究急性腎損傷大鼠模型的尿KIM-1水平在誘導(dǎo)后第一天時(shí)均較誘導(dǎo)前的基線水平有3～5倍的升高，明顯早于其他傳統(tǒng)檢測指標(biāo)的改變，可以作為急性腎衰竭患者不良臨床后果的預(yù)測指標(biāo)[8，10，11]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠CLP術(shù)后大鼠尿KIM-1于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24、48h下降，均顯著高于對照組，與相關(guān)報(bào)道類似[8，10，11]。

IL-18被認(rèn)為與膿毒癥時(shí)臟器功能受損關(guān)系密切，IL-18能促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因如Fasl的表達(dá)及降低抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮促凋亡作用，導(dǎo)致免疫功能紊亂，促進(jìn)臟器功能損傷。曾有研究顯示，在小鼠腎缺血性損傷模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解為成熟形式釋放入尿，并可在尿中被檢測出，目前經(jīng)常選用的評價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)程度和治療效果的指標(biāo)[2，7，10，12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后大鼠尿IL-18于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24h，48h下降，均顯著高于對照組，與相關(guān)報(bào)道相似[2，7，12]。表明膿毒癥大鼠急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展，可能與炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)。

NGAL是一種分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常腎組織中呈低水平表達(dá)，但在腎缺血/再灌注損傷和順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中，損傷后3h時(shí)的尿液中即可檢測到NGAL，明顯早于尿NAG、β2微球蛋白及Scr的改變，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2h時(shí)尿NGAL水平與AKI程度相關(guān)，是AKI獨(dú)立預(yù)測因子，也是目前基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常選用的評價(jià)急性腎功能損傷的指標(biāo)[2，4，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后大鼠尿NGAL、于1h開始明顯升高，12h達(dá)高峰，24、48h下降，均顯著高于對照組，與有報(bào)道升高提前[2，7，8，10]，可能與本實(shí)驗(yàn)在制作模型時(shí)大鼠的選擇，觀察時(shí)間分段不一有關(guān)。

烏司他?。║TI）是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜及細(xì)胞亞膜、穩(wěn)定溶酶體膜抑制溶酶體釋放、清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)，抑制蛋白質(zhì)分解代謝亢進(jìn)，以及多種蛋白酶活性等藥理作用，并對多臟器損傷有保護(hù)作用[2-4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏司他丁治療組12、24、48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Scr、Urea均顯著低；烏司他丁治療組6、12、24、48h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)尿KIM-1、NGAL、IL-18含量顯著低，與國內(nèi)外報(bào)道相似[2-4，13-15]。烏司他丁可能因減輕中性粒細(xì)胞的局部浸潤，抑制炎癥介質(zhì)釋放等機(jī)制對急性腎損傷大鼠腎功能起到保護(hù)作用。

本研究通過CLP復(fù)制膿毒癥急性腎損傷模型，經(jīng)烏司他丁治療，顯示了很好的腎臟保護(hù)作用，可能通過清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放等機(jī)制，達(dá)到對膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟起到保護(hù)作用。

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