關淑英+武峰+趙彬

[摘要] 目的 研究絲素-氧化石墨烯復合膜（SF-GO）的細胞毒性。 方法 采用MTT比色法檢測含有不同濃度氧化石墨烯（0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%）制成的絲素-氧化石墨烯復合膜在不同時期（1 d、3 d、5 d、7 d）對小鼠成纖維細胞L929 細胞相對增殖率（RGR）的影響；通過透射電鏡觀察各組細胞的形態(tài)，最終評價絲素-氧化石墨烯復合膜的細胞毒性。 結果 隨著氧化石墨烯濃度的增加，細胞毒性在不斷增加（P﹤0.01）；隨著測定天數(shù)的增加，氧化石墨烯的細胞毒性雖減小，但無統(tǒng)計學意義，且各組總體趨勢均在減小；通過透射電鏡照片可見各組細胞形態(tài)基本正常，細胞生長良好，為長梭形或卵圓形， 并可見圓形分裂細胞， 細胞折光性強。結論 氧化石墨烯濃度≤1wt%時無明顯細胞毒性。

[關鍵詞] 氧化石墨烯；細胞毒性；MTT法

[中圖分類號] R318.08 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）17-0018-03

MTT assay for cetection of the cytotoxicity of graphene oxide

GUAN Shuying WU Feng ZHAO Bin

Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To study the cytotoxicity of silk fibroin-graphene oxide composite film（SF-GO）. Methods MTT assay was applied to test the impact of silk fibroin-graphene oxide composite film containing different graphene oxide concentrations（0.1 wt%， 0.2 wt%， 0.5 wt%， 1.0 wt%） at different periods（1d， 3d， 5d， 7d） on the relative growth rate （RGR） of rat fibroblast L929， and transmission electron microscope was applied to observe cell shape in different groups. The cytotoxicity of silk fibroin-graphene oxide composite film was evaluated. Results The cytotoxicity kept increasing with increase of graphene oxide concentration（P<0.01）. With days passing by， the cytotoxicity of graphene oxide gradually decreased without statistical significance， but the overall trend of decreased cytotoxicity was observed in all groups. Transmission electron microscope demonstrated that all groups had normal cell shape and good cell growth with spindle or oval shapes. Circular splinter cells were observed with strong cellular refractivity. Conclusion There is no obvious cytotoxicity with graphene oxide concentration≤1 wt%.

[Key words] Graphene oxide； Cytotoxicity； MTT assay

牙列缺損或牙列缺失是口腔修復中最常見的疾病，目前治療牙列缺損、缺失的最佳方法為種植修復，但種植體植入后需要等待骨愈合的時間較長，期間會影響患者的咀嚼、說話功能，因而許多患者不愿意進行種植修復，從而影響了種植修復技術在臨床中的應用。因此如何縮短種植骨植入后的愈合期成為當前種植領域的一大熱點。辛伐他?。╯imvastatin）是3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，近年來研究指出：辛伐他汀不僅能夠有效降低膽固醇和低密度脂蛋白[1]，還可能促進松質骨的骨量增加，減少骨折發(fā)生[2]。然而，他汀類藥物主要作用部位是肝細胞，在其他組織中的分布濃度非常低， 要使他汀類藥物對骨組織發(fā)揮有效作用則需要對骨組織局部用藥，需要加入一種緩釋劑使辛伐他汀小量而連續(xù)緩慢定量釋放，以達到促進骨形成的效果。近年來，石墨烯衍生物成為納米生物醫(yī)學領域研究的熱點[3，4]。氧化石墨烯為石墨烯衍生物。大量研究表明，氧化石墨烯沒有明顯的細胞毒性，且分散性能好，是一種性能優(yōu)良的藥物載體，并且是一種良好的藥物緩釋劑。絲素蛋白是蠶絲的主體，研究表明[5]它具有良好的生物相容性、無毒、無污染、無刺激性、可生物降解，常被用于細胞培養(yǎng)的基質和組織工程。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠成纖維細胞 （L-929，中科院上海細胞資源中心）；四甲基偶氮唑鹽（M TT，Sigma，美國）；新生小牛血清 （杭州四季青有限公司）；絲素蛋白（SF，美國）；氧化石墨烯（GO，美國）；PBS緩釋液（自配）；二甲基亞砜（Sigma，美國）；0.25% 胰酶（Hyclone，美國）； JEOLJEM-1200EX透射電鏡（日本電子）；CARY100紫外可見吸收光譜儀（瓦里安，美國）；DNM-9602酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）； 倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）；超凈臺、 CQ50 超聲波清洗器等。

1.2方法與步驟

1.2.1 PBS溶液的配制NaCl 8 g， KCl 0.2 g， Na2HPO4 1.56 g， KH2PO4 0.2 g， 加蒸餾水1000 mL。

1.2.2 MTT試劑的配制 將粉狀 MTT 以 5 g/L的濃度溶于配制的100 mL PBS 溶液， 抽濾滅菌。

1.2.3絲素-氧化石墨烯復合膜（SF-GO）的制備 先將氧化石墨烯在真空干燥箱中干燥24 h，稱取一定量的氧化石墨烯分散在二次水中，超聲1 h，得到氧化石墨烯分散液，分別取出一定量的分散液加入到5個錐形瓶中，加二次水至10 mL，加入50 μL的冰醋酸，稱取100 mg絲素蛋白5份，加入錐形瓶中，攪拌混合，將混合液倒入6孔板中，超聲15 min脫氣泡，50℃烘干48 h，得到氧化石墨烯添加量為0 wt%、0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%絲素-氧化石墨烯復合膜。

1.2.4 測定材料的細胞相對增殖率 將制作好的不同濃度的絲素-氧化石墨烯復合膜剪成直徑為1 cm的小圓片，放入24孔板，各4孔，共接種4塊板，每個孔分別加入1 mL的PBS液，將0 wt%濃度組設為對照組，15 min后將所有孔中PBS液吸出。將濃度為2.5×107個細胞/L的小鼠成纖維細胞 L929細胞懸液接種于放有不同濃度絲素-氧化石墨烯復合膜（SF-GO）的24孔培養(yǎng)板，每孔 1 mL，然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中開放培養(yǎng) 1、3、5、7 d后分別吸去培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，再加入5 g/L的 MTT液 0.1 mL， 繼續(xù)在37℃培養(yǎng)4 h，吸棄原培養(yǎng)液， 每孔加入2 mL PBS小心清洗 2 次； 棄除余液， 立即在各孔中加入二甲基亞砜1 mL， 室溫放置并輕微振蕩20 min使結晶物充分溶解； 然后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其吸光度值（A），取平均值（波長為490 nm），并將吸光度值（A1）轉換成胞相對增值率（RGR），然后將各組的RGR轉換成細胞毒性級別。細胞毒性試驗[6]采用5分制法進行細胞毒性分級。RGR（%） = 實驗組平均OD值×100%/對照組平均OD值。細胞相對增殖率與細胞毒性的分級的關系：RGR（%）≥100%細胞毒性為0級；RGR（%）為75%～99%，細胞毒性為1級；RGR（%）為50%～74%，細胞毒性為2級；RGR（%）為25%～49%，細胞毒性為3級；RGR（%）為1%～24%，細胞毒性為4級；RGR（%）為0%時，細胞毒性為5級。0級和1級被認為沒有細胞毒性，2級為輕度細胞毒性，3級和4級為中度細胞毒性，5級為明顯細胞毒性。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗中OD值用均數(shù)±標準差表示，增值率用百分數(shù)表示，通過SPSS17.0 軟件包進行統(tǒng)計學處理，相應的各組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1細胞毒性評價

2.1.1細胞形態(tài)觀察 透射電鏡照片可見各組細胞形態(tài)正常，細胞生長良好，為長梭形或卵圓形， 并可見圓形分裂細胞， 細胞折光性強，表明氧化石墨烯濃度≤1wt%時無明顯細胞毒性，見圖1。

圖1 各組培養(yǎng)1 d后細胞形態(tài)（×500）

2.1.2 各組細胞OD值、細胞增殖率及細胞毒性 見表1。由表1可以看出，隨著氧化石墨烯濃度的增加細胞增殖率在不斷降低，細胞毒性在增加，各組差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。隨著測量天數(shù)的增加，細胞增殖率在不斷增加，細胞毒性在減小，各組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。氧化石墨烯濃度為0.1 wt%組在第7天，細胞增長非但未受抑制，反而增長。

3 討論

2004年，英國Manchester大學Geim等通過努力成功制備了世界上最薄的新型二維納米材料-石墨烯 [7]，其厚度僅為0.35 nm[8]。石墨烯具備較好的電學、力學和熱學等性能[9]，使其在眾多領域具有重要的應用前景[10]，成為近年來納米領域研究的熱點。但在生物醫(yī)學領域其衍生物氧化石墨烯應用較多，它是用石墨經(jīng)氧化、超聲制備而來。近年來研究表明，氧化石墨烯沒有明顯的細胞毒性且分散性能好，可以作為一種性能優(yōu)良的藥物載體，并且是一種良好的藥物緩釋劑。

該實驗采用MTT比色法也叫四甲基偶氮唑藍比色法[11]，其基本原理為MTT的環(huán)可以被存在于活細胞中位于細胞色素b和細胞色素c位點的細胞線粒體琥珀酸脫氫酶裂解，從而將淡黃色的MTT催化還原為藍色難溶性的結晶物沉積在細胞內，通過結晶物顏色的深淺反映結晶物的多少，從而反映細胞的多少及細胞新陳代謝活性的強弱。該比色法操作簡便、靈敏度高且可以定量評價，目前被廣泛應用于體外細胞毒性的評價。本實驗通過比較小鼠成纖維細胞L929 細胞在氧化石墨烯濃度為0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%的絲素-氧化石墨烯復合膜在不同時間段的增殖率來評價氧化石墨烯的細胞毒性。結果顯示，細胞毒性與氧化石墨烯的濃度呈正相關，因絲素本身不具有細胞毒性，所以細胞毒性來自氧化石墨烯且具有濃度依賴性；隨著測量天數(shù)的增加，細胞毒性在減小，雖各組在1、3、5、7 d差異無統(tǒng)計學意義，但各組細胞毒性總體趨勢在減小，其原因為隨著時間的延長，氧化石墨烯的釋放量在減少。通過表1可知，除氧化石墨烯濃度為1.0 wt%時在1、3 d細胞毒性為2外，其余各組細胞毒性為0、1，表明濃度為0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%的氧化石墨烯無細胞毒性，而且氧化石墨烯濃度為0.1wt%組在第7天，細胞增長非但未受抑制，反而增長。濃度為1.0 wt%的氧化石墨烯有輕度細胞毒性。通過電鏡圖片可以發(fā)現(xiàn)各組細胞形態(tài)基本正常，細胞生長良好，遮光性強，說明細胞毒性小。石墨烯產(chǎn)生細胞毒性的機制：①石墨烯特殊結構導致其在細胞膜上的聚集、沉積表現(xiàn)出一定的毒性。②細胞毒性作用還包括受caspase 3介導的細胞凋亡機制。③細胞毒性作用還來自氧化應激機制即自由基損傷。目前作為藥物載體，氧化石墨烯的應用主要集中在小分子藥物輸運方面[12]，有可能進一步推廣到基因和蛋白藥物的輸運、治療方面，在其他方面的工作還比較少，有待于更進一步的研究。

綜上所述，低濃度的氧化石墨烯無明顯細胞毒性，因此，氧化石墨烯可以用于口腔修復的治療中。

[參考文獻]

[1] 宋文植，尹萬忠，楊歡，等. MTT法檢測納米金粒子體外細胞毒性的研究[J]. 中國實驗診斷學，2011，15（8）：1242-1245.

[2] Mundy G，Garret R，Harris S，et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J]. Science，1999， 28（6）：1946-1949.

[3] Delahoy PJ，Magliano DJ，Webb K，et al. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes：an updated meta-analysis[J]. Clin Ther，2009，31（8）：236-244.

[4] Mohantyn，Berry V.Graphene.based single.bacterium Resolution biode-viee and DNA transistor：interfacing grapheme derivatives with nanoBcaleand miemscale biocomponents[J]. Nano Lett，2008，12（8）：4469-4476.

[5] Shancs，Yanghf，Songjf，et al. Directelectro-chemistry of glucose oxidase and biosensing for glucose based on graphene[J]. Anal Chem，2009，8（1）：2378-2382.

[6] Sun X，Liu Z，Welsherk，et al. Nano-graphene oxide for cellular imagirig and drug delivery[J]. Nano Res，2008，13（1）：203-212.

[7] Peng C， Hu WB， Zhou YT. Intracellular imaging with a grapheme-based fluorescent probe[J]. Small， 2010， 21（6）： 1686-1692.

[8] Novoselovks， Geimak，Morozovsv，et al. Electric field effect in atomicallythin carbon films[J]. Science，2004，30（6）：666-669.

[9] Leecg，Weixd，Kysarjw，et al. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayergrapheme[J].Science，2008，3（21）：385-388.

[10] Lin FS， Cheng CT， Liu WC， et al. Chemical auxiliary-free Polymerization yielding non-linear PEG for protein-resistant application[J]. Rsc Advances，2012，2（18）： 7174-7179.

[11] 劉瓊，王娟，陳秀華. Fe3O4 納米粒子-氧化石墨烯納米復合物的制備、表征及體外毒性評價[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（3）：253-257.

[12] Shao Q， Wu P， Xu X Q， et al. Insight into the effects of graphene oxide sheets on the conformation and activity of glucose oxidase： towards developing a nanomaterial-based protein conformation assay[J]. Phys Chem Chem Phys，2012，14（25）： 9076-9085.

（收稿日期：2014-04-08）

綜上所述，低濃度的氧化石墨烯無明顯細胞毒性，因此，氧化石墨烯可以用于口腔修復的治療中。

[參考文獻]

[1] 宋文植，尹萬忠，楊歡，等. MTT法檢測納米金粒子體外細胞毒性的研究[J]. 中國實驗診斷學，2011，15（8）：1242-1245.

[2] Mundy G，Garret R，Harris S，et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J]. Science，1999， 28（6）：1946-1949.

[3] Delahoy PJ，Magliano DJ，Webb K，et al. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes：an updated meta-analysis[J]. Clin Ther，2009，31（8）：236-244.

[4] Mohantyn，Berry V.Graphene.based single.bacterium Resolution biode-viee and DNA transistor：interfacing grapheme derivatives with nanoBcaleand miemscale biocomponents[J]. Nano Lett，2008，12（8）：4469-4476.

[5] Shancs，Yanghf，Songjf，et al. Directelectro-chemistry of glucose oxidase and biosensing for glucose based on graphene[J]. Anal Chem，2009，8（1）：2378-2382.

[6] Sun X，Liu Z，Welsherk，et al. Nano-graphene oxide for cellular imagirig and drug delivery[J]. Nano Res，2008，13（1）：203-212.

[7] Peng C， Hu WB， Zhou YT. Intracellular imaging with a grapheme-based fluorescent probe[J]. Small， 2010， 21（6）： 1686-1692.

[8] Novoselovks， Geimak，Morozovsv，et al. Electric field effect in atomicallythin carbon films[J]. Science，2004，30（6）：666-669.

[9] Leecg，Weixd，Kysarjw，et al. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayergrapheme[J].Science，2008，3（21）：385-388.

[10] Lin FS， Cheng CT， Liu WC， et al. Chemical auxiliary-free Polymerization yielding non-linear PEG for protein-resistant application[J]. Rsc Advances，2012，2（18）： 7174-7179.

[11] 劉瓊，王娟，陳秀華. Fe3O4 納米粒子-氧化石墨烯納米復合物的制備、表征及體外毒性評價[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（3）：253-257.

[12] Shao Q， Wu P， Xu X Q， et al. Insight into the effects of graphene oxide sheets on the conformation and activity of glucose oxidase： towards developing a nanomaterial-based protein conformation assay[J]. Phys Chem Chem Phys，2012，14（25）： 9076-9085.

（收稿日期：2014-04-08）

綜上所述，低濃度的氧化石墨烯無明顯細胞毒性，因此，氧化石墨烯可以用于口腔修復的治療中。

[參考文獻]

[1] 宋文植，尹萬忠，楊歡，等. MTT法檢測納米金粒子體外細胞毒性的研究[J]. 中國實驗診斷學，2011，15（8）：1242-1245.

[2] Mundy G，Garret R，Harris S，et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J]. Science，1999， 28（6）：1946-1949.

[3] Delahoy PJ，Magliano DJ，Webb K，et al. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes：an updated meta-analysis[J]. Clin Ther，2009，31（8）：236-244.

[4] Mohantyn，Berry V.Graphene.based single.bacterium Resolution biode-viee and DNA transistor：interfacing grapheme derivatives with nanoBcaleand miemscale biocomponents[J]. Nano Lett，2008，12（8）：4469-4476.

[5] Shancs，Yanghf，Songjf，et al. Directelectro-chemistry of glucose oxidase and biosensing for glucose based on graphene[J]. Anal Chem，2009，8（1）：2378-2382.

[6] Sun X，Liu Z，Welsherk，et al. Nano-graphene oxide for cellular imagirig and drug delivery[J]. Nano Res，2008，13（1）：203-212.

[7] Peng C， Hu WB， Zhou YT. Intracellular imaging with a grapheme-based fluorescent probe[J]. Small， 2010， 21（6）： 1686-1692.

[8] Novoselovks， Geimak，Morozovsv，et al. Electric field effect in atomicallythin carbon films[J]. Science，2004，30（6）：666-669.

[9] Leecg，Weixd，Kysarjw，et al. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayergrapheme[J].Science，2008，3（21）：385-388.

[10] Lin FS， Cheng CT， Liu WC， et al. Chemical auxiliary-free Polymerization yielding non-linear PEG for protein-resistant application[J]. Rsc Advances，2012，2（18）： 7174-7179.

[11] 劉瓊，王娟，陳秀華. Fe3O4 納米粒子-氧化石墨烯納米復合物的制備、表征及體外毒性評價[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（3）：253-257.

[12] Shao Q， Wu P， Xu X Q， et al. Insight into the effects of graphene oxide sheets on the conformation and activity of glucose oxidase： towards developing a nanomaterial-based protein conformation assay[J]. Phys Chem Chem Phys，2012，14（25）： 9076-9085.

（收稿日期：2014-04-08）