李咪咪　劉洪梅　張帆　梁衛(wèi)紅

摘要：以日本晴（Wt）和光敏色素A、B的突變體（phyA，phyB）3個水稻（Oryza stiva L.）粳稻品種為試材，檢測其在生長發(fā)育過程中葉片組織的葉綠素含量，并采用半定量RT-PCR和實時定量PCR技術，檢測水稻MAPK基因OsMPK14在葉片中的表達特性。結果表明，在水稻生長發(fā)育過程中，光敏色素A和B的突變葉片葉綠素含量呈下降趨勢；表達模式分析顯示，OsMPK14基因在3個水稻品種的葉片中具有不同水平的表達，在Wt和phyA植株葉片中的表達呈現(xiàn)出波動性，而在phyB中隨著生長進程的延續(xù)呈上升趨勢。

關鍵詞：水稻（Oryza stiva L.）；光敏色素突變體；OsMPK14基因；葉綠素含量；表達特性

中圖分類號：S511；Q75 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1178-04

對高等植物來說，光不僅能決定植物的光合作用，而且是調控植物生長發(fā)育和代謝活動的重要環(huán)境信號分子[1]。對于生長環(huán)境中光條件的變化，高等植物主要是利用光敏色素（Phytochromes，phy）、隱花色素（Cryptochromes）和向光素（Phototropins）這三種光受體，通過一系列復雜的信號轉導反應來調節(jié)自身的生長發(fā)育，最終適應周圍環(huán)境的變化[1-4]。

光敏色素主要感受紅光和遠紅光信號[3，5]。水稻（Oryza stiva L.）中一共有3個編碼光敏色素的基因，即PHYA、PHYB和PHYC，它們都是單拷貝且均位于水稻的第3號染色體上[1，4]。利用反轉座子和γ射線誘變的方法，Takano等[5]研究獲得了水稻光敏色素A和B的突變體。已有研究表明，水稻光敏色素在水稻幼苗去黃化[3，6，7]、根的伸長[8]和向地性[7]、植株形態(tài)[9]等發(fā)育過程中起重要作用。

MAPK是一類存在于所有真核生物中、高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK和其上游的MAPKK（MAPK激酶）、MAPKKK（MAPKK激酶）共同組成一條重要的信號傳遞途徑。研究顯示，MAPK 級聯(lián)反應參與植物的生長發(fā)育[10]、生物及非生物脅迫反應[11，12]、激素應答[13]、細胞分化和發(fā)育調控[10，14]等生命過程。但是，有關光敏色素光信號在調節(jié)MAPK基因表達方面的研究尚未見報道。

全基因組序列預測分析表明，水稻中有17種MAPK基因，分別被命名為OsMPK1～OsMPK17，并將其劃分為A～F 6組[15]。研究表明，MAPK參與水稻生物和非生物脅迫應答以及水稻生長發(fā)育過程[16]，如OsMKK4-OsMPK3/OsMPK6可通過調節(jié)生物合成基因的表達，從而產生雙萜類植物抗毒素[17]。在水稻生長發(fā)育后期，OsMPK4基因的表達量在葉、根和幼穗中都有所增加[18，19]。Jeong等[20]研究發(fā)現(xiàn)OsMPK7基因在水稻根中有很強的組成型表達。

河南師范大學植物生長發(fā)育調控實驗室采用序列拼接和RT-PCR技術，克隆了水稻OsMPK14基因完整的cDNA編碼區(qū)，表達模式分析顯示，該基因在水稻不同組織中廣泛且差異表達，且在地上部分的表達可能受光照的負調控[21]。為了深入研究該基因在水稻整個生長發(fā)育過程中的表達特性，以及與光敏色素光信號通路之間的關系，本研究以水稻粳稻品種日本晴（Oryza sativa L.，Japonica cv. Nipponbare）和光敏色素A、B的突變體為材料，分別采用半定量RT-PCR和實時定量PCR技術，分析了OsMPK14基因在葉片中的表達特性，旨在了解在水稻發(fā)育過程中光敏色素光信號通路對OsMPK14基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1 供試材料

粳稻品種日本晴野生型（簡稱Wt）、具有日本晴遺傳背景的光敏色素A突變體（phyA）和光敏色素B突變體（phyB），由山東省農業(yè)科學院高新技術研究中心謝先芝研究員饋贈。

1.2 供試試劑

PCR相關試劑和總RNA提取試劑TRNzol[天根生化科技（北京）有限公司]、M-MLV反轉錄酶（Promega生物技術有限公司）、DNaseⅠ酶（Fermentas 生物技術有限公司）、PrimeScript？誖 RT Enzyme Mix Ⅰ和SYBR？誖 Premix Ex TaqTM[寶生物工程（大連）有限公司]。

1.3 方法

用75%乙醇將水稻種子完全消毒后，于2012年5月3日點種于河南師范大學生物試驗園地，30、60、90 d時取植株頂部完全伸展且無任何損傷的葉片，用于葉綠素含量的測定和總RNA的提取。

1.3.1 葉綠素含量的測定 利用乙醇法[22]萃取葉綠素，并于722N型可見光分光光度計上測定萃取液在波長645 nm和663 nm下的吸光度，分別按照以下公式計算。

葉綠素A濃度（Ca，mg/L）=13.95A663 nm-6.88A645 nm

葉綠素B濃度（Ca，mg/L）=24.96A645 nm-7.32A663 nm

總葉綠素濃度（Ca，mg/L）=葉綠素A濃度+葉綠素B濃度

葉綠素含量（mg/g）=（葉綠素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮重

1.3.2 總RNA的提取 按TRNzol試劑說明書，提取水稻葉片總RNA，并通過DNA快速電泳檢測總RNA質量，并根據A260 nm/A280 nm比值確定其純度及濃度。

1.3.3 半定量RT-PCR檢測 按M-MLV反轉錄酶說明書進行cDNA的合成。采用25 μL反轉錄體系，反應體系：1 μL Oligo（dT）15（0.5 μg/μL）、0.63 μL RNA酶抑制劑（40 U/μL ）、5 μL dNTP Mix（10 mmol/L）和 M-MLV RT Buffer（5×）、1 μL M-MLV RT（200 U/μL）、總RNA取1 μg，補加RNase-free 水至25 μL。

以水稻肌動蛋白基因OsAct1作為內參進行半定量RT-PCR，所用引物為P1/P2（表1）。PCR擴增條件：94 ℃預變性 1 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，24個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。OsMPK14擴增引物為P3/P4（表1）。PCR擴增條件：94 ℃預變性 1 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，24個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.3.4 qRT-PCR檢測 采用40 μL反轉錄體系合成cDNA，反應體系2 μL Oligo（dT）15（50 μmol/L）和隨機6聚引物（100 μmol/L）、8 μL PrimeScript？誖 Buffer（5×）、2 μL PrimeScript？誖RT Enzyme Mix Ⅰ、總RNA不超過2 μg，補加RNase-free 水至40 μL。

以水稻肌動蛋白基因OsAct1作為內參，所用引物為P5/P6，OsMPK14基因擴增引物為P7/P8（表1）。采用20 μL的反應體系：10 μL SYBR？誖Premix Ex TaqTM（2×）、0.4 μL PCR引物（10 μmol/L）、

0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ（50×）、2 μL cDNA模板、6.8 μL滅菌雙蒸水。采用兩步法PCR擴增標準程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，進行40個循環(huán)。每個樣品做3次平行反應。

1.3.5 數(shù)據分析 數(shù)據統(tǒng)計和顯著性分析采用SPASS V13軟件。qRT-PCR數(shù)據分析采用SDS Software v 1.4軟件，以2-△△Ct法分析OsMPK14基因表達水平。

2 結果與分析

2.1 3個水稻品種生長發(fā)育過程中葉綠素含量

隨著水稻的生長發(fā)育，野生型Wt和光敏色素突變體phyA、phyB水稻葉片中的葉綠素含量均呈現(xiàn)不同的下降，但是在同一時期3個品種葉片中葉綠素含量有一定的差異。其中突變體phyA的葉綠素含量在30 d時低于野生型Wt，但在60 d和90 d時則高于野生型Wt。突變體phyB水稻葉片中的葉綠素含量在3個時期均高于野生型Wt和突變體phyA。

2.2 OsMPK14基因在3個水稻品種葉片中的表達特性

以組成型表達的水稻肌動蛋白基因OsAct1為內參，通過半定量RT-PCR檢測OsMPK14基因在日本晴Wt、phyA和phyB 3個水稻品種30、60、90 d時地上部分的時空表達特性（圖2）。結果表明，OsMPK14基因在Wt、phyA和phyB水稻葉片中都有表達，但表達水平存在差異。其中30 d時該基因在phyA中的表達量明顯高于其他2個品種。

進一步采用qRT-PCR定量檢測OsMPK14基因的表達差異（圖3）。從圖3可以看出，OsMPK14基因在3個水稻品種葉片中廣泛表達，且整體變化趨勢與半定量RT-PCR的檢測結果基本一致。OsMPK14基因在Wt發(fā)育的不同時期表達量沒有明顯的變化，在phyA發(fā)育的不同時期呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，其中在30 d的水稻葉片中，OsMPK14基因在phyA中的表達量是在另外2個品種中表達量的2.7倍、4.2倍。而該基因在phyB發(fā)育的不同時期表達量則呈持續(xù)升高的趨勢。

3 小結與討論

光敏色素信號轉導途徑中的第二信使有G蛋白、Ca2+、cGMP、二脂酰甘油和IP3等，可誘導葉綠素和花青素生物合成酶基因的表達[23]。有研究表明，擬南芥中的光敏色素B可參與調節(jié)葉綠素的合

成[24]。在水稻中光敏色素B感受紅光正調控葉綠素的合成，且光敏色素A和B存在功能上的冗余[25]。本研究通過比較3個水稻品種在3個典型時期葉綠素的含量，發(fā)現(xiàn)phyA基因在水稻發(fā)育早期正調控葉綠素含量，在發(fā)育中、后期則負調控葉綠素含量，但是從整體來看phyA突變使水稻葉綠素含量的下降幅度沒有野生型下降幅度大。突變體phyB的葉綠素含量在3個時期均高于野生型和突變體phyA，這表明phyB基因在整個發(fā)育過程中負調控葉綠素的含量。葉綠素的含量受葉綠素分解代謝和合成代謝的雙重調控，葉綠素含量的變化與葉綠素代謝的哪個途徑有關，有待進一步研究。

MAPK作為MAPK級聯(lián)反應的重要組成部分，在應答多種信號中起重要作用。研究表明，MAPK可能參與水稻多種不同生長發(fā)育過程[18， 19， 26]。例如，OsMPK2基因在水稻幼苗所有組織中均有表達，但成熟期僅在花器官中表達[27]，OsMPK8基因則在葉中表達水平較高[19]。本研究結果表明，日本晴水稻中OsMPK14基因在葉片中廣泛表達，且表達水平維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，說明該基因與葉片生長發(fā)育密切相關。

光照和OsMPK14基因表達之間有一定的關

聯(lián)[21]，但是紅光和遠紅光信號對該基因表達的影響尚不清楚，而且水稻光敏色素信號通路與MAPK級聯(lián)反應之間的聯(lián)系鮮見報道。本研究采用具有日本晴遺傳背景的光敏色素A和B突變體，比較了OsMPK14基因在突變體中的表達特性。結果表明，這2種光敏色素的突變對該基因在葉片中的表達有不同的影響。突變體phyA中，OsMPK14基因在幼苗期（30 d）表達量顯著高于對照日本晴，是其2.7倍，說明phyA的突變對該基因的表達在發(fā)育早期是促進效應，這一特點也體現(xiàn)在成熟期（90 d，1.7倍）；但在營養(yǎng)生長向生殖生長轉換期，phyA突變對該基因的影響不顯著。而光敏色素B的突變體phyB在水稻幼苗期時表現(xiàn)為對OsMPK14基因表達的抑制效應，表達量是對照日本晴的60%，當水稻由營養(yǎng)生長向生殖生長轉換并且逐漸成熟時，phyB的突變對該基因的表達則為促進效應，分別是其1.2倍和1.6倍。說明由紅光/遠紅光通過光敏色素受體介導的信號通路對OsMPK14基因表達的調控具有發(fā)育時期的特異性，且phyA和phyB的作用機制不同，而光對OsMPK14基因表達的調控機制十分復雜，其內在機制尚需深入研究。

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