高星杰何津巖葛林張毅付雪尹潔張緯史雪彬蘇征姚智楊潔,△

細胞與分子生物學

針對人SND1基因兩個AUG的細胞應激分析

高星杰1何津巖2葛林2張毅3付雪1尹潔1張緯2史雪彬2蘇征2姚智2楊潔1,2△

目的針對人SND1基因2個蛋白翻譯起始密碼子AUG構建真核表達質粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/ 2，并分析2個AUG在SND1應激顆粒形成中的作用。方法以SND1全長轉錄本為模板，PCR法擴增含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的目的基因SND1-No1/2，雙酶切法分別酶切目的基因片段和線性pCMV-N-Flag，以T4-DNA連接酶將兩者連接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質粒，然后將構建的重組質粒轉染入HeLa細胞內，以Western印跡法檢測Flag標簽（DYKDDDDK）與SND1-No1/2的融合表達，最后以細胞免疫熒光實驗檢測在氧化應激狀態(tài)下Flag-SND1-No1/2融合蛋白與內源性SND1應激顆粒的胞內共定位情況。結果以單/雙酶切及基因測序法鑒定構建的重組質粒無誤，Western印跡結果檢測到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表達；細胞免疫熒光結果顯示Flag-SND1-No1/2均可與內源性SND1應激顆粒共定位。結論重組pCMV-N-Flag-SND1-No1/2質粒構建成功，SND1基因第1個AUG的缺失并不影響SND1應激顆粒的形成。

重組融合蛋白質類；應激；質粒；基因表達；SND1；AUG；應激顆粒

人類SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白，又稱為p100或Tudor-SN（Tudor staphylococcal nuclease），參與基因轉錄、細胞應激、pre-mRNA剪切等多種生物學過程[1-3]。研究發(fā)現，多個物種的SND1基因序列中存在2個蛋白翻譯起始密碼子AUG[4-5]，而目前對于它的功能探討尚少見。本課題針對人類SND1基因的兩個AUG，分別構建pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質粒，在真核細胞內融合表達N端攜帶Flag標簽的SND1-No1蛋白（以第1個AUG為起始點）與SND1-No2蛋白（以第2個AUG為起始點），繼而進行細胞免疫熒光實驗，從細胞應激角度分析兩個AUG在SND1應激顆粒形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、細胞及菌株pCMV-N-Flag載體購自碧云天公司；SND1全長轉錄本FL23924購自美國復能基因；HeLa細胞來自本實驗室；Trans1-T1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 試劑與儀器Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術公司；限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗購自Fermentas公司；T/A載體（pEASY-T1）購自北京全式金生物技術有限公司；質?？焖傩√嵩噭┖匈徸员本┧鱽韺毧萍加邢薰?；DNA快速凝膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司；Lipofectamine 2000、Alexa Fluor 555標記的驢抗羊IgG熒光二抗、Alexa Fluor 488標記的驢抗鼠IgG熒光二抗購自Invitrogen公司；去內毒素質粒提取試劑盒購自Promega公司；BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce公司；多克隆羊源抗SND1抗體、DAPI染料購自Santa公司；LumiGLo化學發(fā)光底物購于KPL公司；單克隆鼠源抗Flag抗體、單克隆鼠源抗β-actin一抗、亞砷酸鹽購自Sigma公司；激光共聚焦皿購自NEST公司；激光共聚焦熒光顯微鏡（基礎醫(yī)學研究中心）購自日本Olympus公司；引物合成及基因測序工作由北京天一輝遠公司完成。

1.2 方法

1.2.1 獲取目的基因片段首先根據SND1的蛋白編碼區(qū)序列（NM_014390.2）設計含有BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶位點的引物序列，見表1。再以質粒快速小提試劑盒提取包含SND1全長轉錄本的FL23924質粒，并以其為模板，PCR擴增目的片段，條件為95℃預變性5 min，95℃30 s，60℃50 s，72℃3 min，進行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進行目的片段回收，在T4 DNA連接酶作用下，與pEASY-T1（T/A載體）25℃連接15 min。連接產物轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞，在含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取質粒。以BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化各目的片段。

Tab.1 The primer sequences of SND1-NO1/2 gene fragment表1 SND1-No1/2基因片段引物序列

1.2.2 線性pCMV-N-Flag的獲取以質?？焖傩√嵩噭┖刑崛CMV-N-Flag質粒，進行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，完整切下線性pCMV-N-Flag質粒載體，0.75％瓊脂糖電泳分離。凝膠回收試劑盒回收得到4 321 bp的線性pCMV-NFlag。

1.2.3 重組真核表達質粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/2的構建在T4 DNA連接酶作用下，將線性pCMV-N-Flag質粒載體與具有相同黏性末端的SND1-No1/2功能片段進行22℃連接過夜。連接產物轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取重組質粒。

1.2.4 酶切及基因測序鑒定用BamHⅠ和EcoRⅠ對重組質粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/2進行單、雙酶切，并以0.75％的瓊脂糖凝膠電泳驗證片段的大小。同時，對重組質粒進行基因測序鑒定。

1.2.5 細胞轉染及Western印跡檢測以去內毒素質粒提取試劑盒提取無內毒素pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質粒。HeLa細胞接種至激光共聚焦皿中，置于含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞80％匯合時，依據產品說明書進行脂質體瞬時轉染重組質粒。分別轉染pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質粒以及pCMV-N-Flag空載對照質粒后48 h，先以預冷的1×PBS溶液洗滌轉染后HeLa細胞3次，加入預冷的1×NP-40裂解液裂解細胞，晃動培養(yǎng)板數次以確保裂解液完全覆蓋細胞，用無菌的細胞刮刮取細胞并轉移至一個1.5 mL Eppendorf管中，冰浴20 min。超聲破碎細胞后4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清獲得全細胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl pH6.8，2％SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油，2.5％β-巰基乙醇），99℃熱變性5 min，進行6％SDS-PAGE電泳。電泳結束后，以半干轉法將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜，用含5％脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，分別加入單克隆鼠源抗Flag一抗，單克隆鼠源抗β-actin一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗（1∶15 000）室溫孵育1 h，TBST溶液再次洗膜3次，每次10 min。加入LumiGLo化學發(fā)光底物后暗室曝光。

1.2.6 細胞免疫熒光實驗轉染pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質粒后48 h，分為正常組與應激組（0.5 mmol/L亞砷酸鹽，1 h）。4％多聚甲醛室溫固定10 min，加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，5 min/次；0.2％通透液（含0.2％Triton X-100的PBS）室溫靜置通透10 min；再加入1％ BSA封閉1 h。加入多克隆羊源抗SND1一抗和單抗體鼠源抗Flag一抗的混合液（1∶100）4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，10 min/次。再加入Alexa Fluor 555標記的驢抗羊IgG熒光二抗與Alexa Fluor 488標記的驢抗鼠IgG熒光二抗的混合液（1∶800），4℃孵育8 h。PBS洗滌3次，10 min/次。最后以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光信號。每組實驗檢測50個細胞，分別重復3次。

2 結果

2.1PCR擴增目的片段以SND1全長轉錄本為模板，針對2個AUG進行PCR擴增，以0.75％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，結果在2 700 bp左右觀察到與目的片段長度相符的熒光條帶，其中SND1-No2條帶位置比SND1-No1略低，見圖1。

Fig.1 The obtaining of targeting SND1-No1/2 fragment圖1 目的片段SND1-No1/2的獲取

2.2 線性pCMV-N-Flag質粒載體的獲取采用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCMV-N-Flag質粒，切下完整的線性pCMV-N-Flag質粒載體，見圖2。經0.75％的瓊脂糖凝膠電泳，可在4 300 bp左右出現條帶，見圖3。純化回收后用于后續(xù)的連接反應。

Fig.2 The map of pCMV-N-Flag vector圖2 pCMV-N-Flag載體圖譜

2.3 重組真核表達質粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/ 2的鑒定將重組質粒分別進行BamHⅠ和EcoRⅠ的單、雙酶切，經0.75％的瓊脂糖凝膠電泳，產生的條帶大小與預期相符，見圖4，重組質?；驕y序結果也正確。

Fig.3 The obtaining of linear pCMV-N-Flag vector圖3 線性pCMV-N-Flag質粒載體的獲取

Fig.4 Single/double enzyme digestion of pCMV-N-Flag-SND1-No1/2圖4 pCMV-N-Flag-SND1-No1/2的單、雙酶切鑒定圖

2.4Western印跡法檢測融合蛋白表達收集轉染有pCMV-N-Flag-SND1-No1/2和pCMV-N-Flag空載（vector）的HeLa細胞，分別以鼠源抗Flag抗體檢測融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表達，以抗β-actin抗體檢測內源性β-actin的表達。其中Flag-SND1-No1/2蛋白分子質量分別為102.0 ku，99.7 ku。Western印跡法檢測出與目的融合蛋白分子質量相符的蛋白條帶，見圖5。

Fig.5 The data of Western blotting assay圖5 Western印跡結果

2.5 熒光共定位分析見圖6。將pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質粒轉染入HeLa細胞，以抗Flag抗體和抗SND1抗體進行免疫熒光分析，激光共聚焦熒光顯微鏡下可見正常組中Flag-SND1-No1/2主要分布于細胞漿中；當給予0.5 mmol/L亞砷酸鹽氧化應激處理時，兩者均可呈顆粒狀分布，且與內源性的SND1應激顆粒呈共定位關系。

Fig.6 Cellular co-localization analysis of Flag-tagged SND1-No1/2 and endogenous SND1 protein圖6 Flag-SND1-No1/2與內源性SND1的細胞內應激共定位分析

3 討論

多功能SND1蛋白首次是作為EB病毒細胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的轉錄調控激活因子被發(fā)現的[4]，與過敏[1]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多種臨床疾病密切相關。研究證實，人類SND1蛋白（NP_055205.2）由N端4個重復葡萄球菌核酸酶樣（Staphylococcal nucleases-like，SN-like）的SN（1～4）結構域及C端的SN5a-Tudor-SN5b（TSN）結構域組成，其中SN結構域主要參與細胞應激、基因轉錄等過程，而TSN結構域則主要參與premRNA的剪切過程[1-3]。目前從SND1基因多樣性角度分析SND1蛋白的多功能性較受學者關注。如斑馬魚SND1基因被報道存在兩個選擇性剪接異構體SND1L和SND1S，其中SND1L占多數，即為SND1基因全長；SND1S則僅含SN1～3和部分SN4基因[8]。人類SND1 mRNA基因（NM_04390.2）5′端有兩個AUG，兩者之間相差75個bp，理論上分別以第1、2 個AUG為起始密碼子所翻譯的SND1-No1和SND1-No2蛋白的相對分子質量相差25個氨基酸。然而，最初人們對于SND1基因的研究多始于第2個AUG，隨著研究的深入，第1個AUG才被確認[1-5]。SND1基因的兩個AUG是否具有一定的生物學意義尚不明確。本實驗中筆者以pCMV-N-Flag載體為基礎，分別針對人類SND1基因的兩個AUG設計引物，構建pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重組質粒，后者可在真核細胞中特異表達N端攜帶有Flag標簽的SND1-No1/2蛋白。

本研究針對SND1基因的第2個AUG構建了pERFP-SND1重組質粒，轉染入HeLa細胞后成功表達紅色熒光蛋白標記的SND1蛋白；當給予細胞0.5 mmol/L亞砷酸鹽氧化應激處理后，SND1蛋白可在胞漿中形成“應激顆粒”[3]。“應激顆?！笔窃诩毎艿窖趸瘧?、熱休克、紫外線照射、滲透壓休克和病毒感染等各種刺激時在胞漿中產生的顆粒狀結構，是細胞的一種重要保護機制，與多種臨床疾病相關[9]。本實驗即是從“細胞應激”角度探討第1個AUG是否在SND1蛋白應激顆粒形成中發(fā)揮作用。結果表明以2 個AUG為起始密碼子所翻譯的Flag-SND1-No1和Flag-SND1-No2蛋白均可介導細胞SND1應激顆粒的形成，說明第1個AUG在SND1應激顆粒形成中的作用是冗余的。

雖然筆者針對SND1基因的2個AUG也進行了“Kozak規(guī)則”的初步分析，并沒有發(fā)現兩者明顯的差異，但仍然無法排除兩個AUG在SND1基因轉錄調控或選擇性剪接中發(fā)揮作用的可能性，這需要更多的實驗證據。本實驗所構建的pCMV-N-Flag-SND1-No1/2真核重組質粒有助于今后進行此方面的探索。

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（2014-02-11收稿2014-03-19修回）

（本文編輯魏杰）

Analysis of Cellular Stress Response in Two AUG of Human SND1 Gene

GAO Xingjie1,HE Jinyan2,GE Lin2,ZHANG Yi3,FU Xue1,YIN Jie1,ZHANG Wei2,SHI Xuebin2,SU Zheng2, YAO Zhi2,YANG Jie1,2
1Research Center of Basic Medical Science,2 Basic Medical Collgee,3 College of Pharmacy,Tianjin Medical University, Tianjin 300070,China
YANG Jie,E-mail：yangj@tijmu.edu.cn

ObjectiveTo construct eukaryotic Flag(DYKDDDDK)expressing recombinant plasmids,pCMV-NFlag-SND1-No1/2,which contain the coding sequence of human SND1-No1（from 1stAUG）or SND1-No2(from 2ndAUG), and perform the cellular localization analysis of Flag-tagged SND1-No1/2 under stress condition to study the function of the two AUG in the SND1 containing stress granules formation.MethodsThe gene fragments of SND1-No1/2 were amplified by PCR from the whole SND1 transcript and inserted into pCMV-N-Flag expressing vector through BamHI/EcoRI double enzyme digestion and T4 DNA Ligase connection.The recombinant pCMV-N-Flag-SND1-No1/2 plasmids were transfected into HeLa cells and the expression of Flag-SND1-No1/2 fusion proteins was examined by Western blotting assay.Immunofluorescence assay was performed to detect the co-localization of Flag-SND1-No1/2 with endogenous SND1 granule.ResultsThe pCMV-N-Flag-SND1-No1/2 were sequenced and digested correctly by restriction single/double enzyme.The Flagtagged SND1-No1/2 fusion proteins were also detected in transfected HeLa cell by Western blotting assay.Both of them showed the co-localization with endogenous SND1 granule.ConclusionThe recombinant eukaryotic plasmids of pCMV-N-Flag-SND1-No1/2 were constructed successfully and expressed effectively.The depletion of 1stAUG failed to affect the formation of SND1 containing stress granules.

recombinant fusion proteins;stress;plasmids;gene expression;SND1;AUG;stress granules

Q784，Q513

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.001

國家自然科學基金資助項目（31100967，31170830, 31370749，21305103）；國家杰出青年基金項目（31125012）

1天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究中心（郵編300070），2基礎醫(yī)學院，3藥學院

△通訊作者E-mail：yangj@tijmu.edu.cn