楊春燕，張朝賓，王興紅

(1.云南開放大學， 云南 昆明 650500；2.云南大學 微生物研究所，云南 昆明 650091)

〈育種與馴化〉

云南迪慶金江木耳馴化栽培研究*

楊春燕1，張朝賓2，王興紅2

(1.云南開放大學， 云南 昆明 650500；2.云南大學 微生物研究所，云南 昆明 650091)

云南省迪慶州香格里拉縣金江鎮(zhèn)打芝壩村仿野生黑木耳栽培技術極其原始，管理粗放，產量極低，但該種木耳口感細膩，品質極佳，價格高昂。為了提高產量，增加經濟效益，研究組對該木耳進行了菌種分離(菌株YUCM510200)、鑒定，以及菌株的耐高溫和栽培實驗研究。研究結果顯示，該木耳耐高溫，出耳速度快，耳基致密，耳片為薄片型，菊花狀，孕面呈灰黑色，背面有毛。產品外觀、口味和仿野生栽培的木耳基本相同，只是在泡發(fā)時的香氣較弱；生物學效率為每公斤干料產鮮木耳1 300 g，以干品計為100 g。該品種由于耐高溫能力強，在熱帶地區(qū)具有推廣價值。

金江；黑木耳；栽培

黑木耳具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，在我國有悠久的食用歷史。我國是木耳生產大國，占世界黑木耳產量的90%以上。不斷發(fā)現新的優(yōu)良木耳品種，適應不同的氣候環(huán)境，豐富人民群眾的選擇是發(fā)展木耳產業(yè)的基礎。產于云南香格里拉縣金沙江邊的金江鎮(zhèn)興隆村打芝壩的野生黑木耳，香氣濃郁，品質細膩，深受當地人的歡迎，其種植方法是1種較原始的仿野生栽培方法。在清明時節(jié)將3年左右的麻櫟樹砍倒，或利用一些修剪下來的大樹枝椏，在雨水充足的4月、5月搭好架，不對耳木進行砍花和接種，利用孢子的自然傳播接種，第2年開始出耳。由于該木耳僅產于打芝壩村民組，產地極為局限，生產方式極其原始，產量極低，價格逐年攀升。目前，每公斤售價已高達1 200元，產品供不應求[1]。

為了更好地滿足市場需求，對該木耳進行了菌株分離、鑒定和耐高溫實驗及人工栽培實驗，為產業(yè)化栽培奠定基礎?，F將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

樣品采集地點：云南省迪慶洲香格里拉縣金江鎮(zhèn)打芝壩村。選擇發(fā)育良好、朵型正常的耳片，干燥后，帶至實驗室備用。

1.2 木耳的分子鑒定

1.2.1 總DNA提取

木耳先用自來水清洗干凈，再用無菌水沖洗2遍，切取50 mg切碎，放入0.5 mL石英砂的無菌EP管中，用玻璃棒研磨。抽提基因組置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總DNA檢測

用1×TBE緩沖液制備濃度為0.8%的瓊脂糖膠，加入核酸染料Goldview使終濃度為0.5 μg·mL-1，取4 μL的DNA樣品和1 μL的LoadingBuffer混合后點樣，在5 V·cm-1電壓下電泳30 min，紫外燈下檢測。

1.2.3 ITS序列的PCR擴增

擴增引物：采用真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)通用引物ITS4和ITS5，作為上下游引物進行序列擴增，引物由捷瑞生物合成，序列為ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’[2]。

PCR擴增體系：將0.5 mL Eppendorf管放置于冰盒上，然后依次加入5 μL 10×PCR Buffer、4 μL 2.5 mmol·L-1dNTP mix、2 μLForward Primer(10 μmol·L-1)、2 μL Reverse Primer(10 μmol·L-1)、2 μL Template DNA、 0.5 μL Taq DNAase(5 U·μL-1)、34.5 μL ddH2O。

PCR擴增條件為：94℃預變性4 min，然后進入32個循環(huán)(94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸50 s)，循環(huán)結束后于72℃延伸10 min，16℃保溫。

1.2.4 PCR產物檢測

用1×TBE緩沖液制備濃度為1.0%的瓊脂糖膠，加入核酸染料Goldview，使終濃度為0.5 μg·mL-1，取4 μL的DNA樣品和1 μL的LoadingBuffer混合后點樣，在5 V·cm-1電壓下電泳20 min，紫外燈下檢測。

1.2.5 ITS序列的測定

送華大基因公司進行DNA雙向測序。

1.2.6 序列分析

測序數據用Contig Express project軟件進行拼接，然后在NCBI數據庫中進行BLAST比對。下載相關菌株的ITS序列用Clustalx2.1軟件進行多序列比對。通過MEGA3.1軟件構建NJ系統(tǒng)進化樹，在分支上標記1 000次重復獲得的自展檢驗Bootstrap值，以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度[3]。

1.3 木耳菌絲分離

取耳片完整、狀態(tài)良好的新鮮木耳，自來水沖洗干凈，在超凈工作臺中，無菌水清洗3次～5次，用無菌濾紙盡量吸取多余水分，75%酒精浸泡消毒1 min，立即取出耳片，用滅過菌的無菌水清洗3次～5次，無菌濾紙吸去多余的水分，撕開耳片，用解剖刀或鑷子將上下表皮撥開，用無菌竹簽或鑷子刮取少量耳肉于PDA培養(yǎng)基上，放置于28℃培養(yǎng)、純化，獲得1株迪慶黑木耳菌株，菌株編號為YUCM510200。

1.4 木耳菌株(YUCM510200)高溫生長實驗

橡膠木屑煮水配置PDA培養(yǎng)基，取干木屑150 g，加馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g，煮30 min，4層紗布過濾，定容至1 L，調節(jié)pH為7.0。滅菌30 min，倒平板備用。

將迪慶黑木耳(YUCM510200)、毛木耳2(YUCM510202)、分離自版納的皺木耳1(YUCM510203)、褐黃木耳2(YUCM510206)、分離自師宗的褐黃木耳(YUCM510207)和黑木耳(YUCM510072)，于28℃下培養(yǎng)3 d待萌發(fā)良好后置于35℃培養(yǎng)。觀察統(tǒng)計各菌株的生長情況。

1.5 栽培實驗

按以下配方進行出耳實驗：櫟木枝條粉 83%、麥麩15%、石灰15%、石膏1%，培養(yǎng)料含水量約65%。裝袋滅菌1 h后，冷卻至室溫接種。在25℃下培養(yǎng)至菌絲發(fā)滿全袋。在袋壁劃出十字型口，保持濕度和光照，進行出耳實驗。

2 結果和討論

2.1 迪慶木耳的栽培方式

迪慶木耳的栽培方式及耳木上長出木耳的形態(tài)見圖1、圖2。

圖1 搭架培養(yǎng)

圖2 耳木上長出木耳的形態(tài)

由于該木耳的栽培方式只是簡單的將耳木擺放在耳場，不進行人工接種，甚至連樹皮都不砍花。完全依靠孢子的自然傳播接種，故耳木上其它雜菌較多，大部分耳木上的木耳產量都比較少，只有少數耳木上能看到木耳成簇生長。

由于該木耳的產地極為局限，僅在香格里拉縣金江鎮(zhèn)打芝壩村民組出現，其它地方生長不出同樣品質的木耳，加之產量極低，導致該木耳價格高昂。

2.2 分子鑒定

以ITS為依據構建的NJ樹見圖3。

由圖3可知，迪慶金江木耳和黑木耳聚在一起，結合形態(tài)觀察，可以認定，該木耳是黑木耳[3]。

2.3 木耳菌絲的鑒定

將在平板上分離純化的木耳菌絲通過ITS序列擴增，測定其序列(YUCM510200)。結果顯示，菌絲的序列仍然和木耳聚在一起(圖3)，證明分離到的菌絲就是該木耳品種的菌絲。

菌絲在平板上潔白致密，邊緣整齊，生長比較緩慢，具有菌香味。

2.4 分離菌株在35℃條件下耐高溫對比

迪慶木耳耐高溫與其他菌株的對比及顯著性差異分析結果見表1。

從表1可以看出，在35℃條件下，迪慶木耳生長狀態(tài)最好，說明迪慶黑木耳具有較強的耐高溫特性，是高溫型品種。這可能是因為，雖然香格里拉地處高原地區(qū)，但金江鎮(zhèn)打芝壩位于金沙江邊，屬于南亞熱帶干熱河谷氣候，年均氣溫20.4℃，最冷月平均溫度14.2℃[4]。由于原始生境溫度較高，該木耳能夠耐受較高的環(huán)境溫度。褐黃木耳(YUCM510206)、皺木耳(YUCM510203)分離自景洪，雖然景洪屬熱帶季風氣候，年平均氣溫21.7℃，最高氣溫41.1℃。但在35℃的高溫下，皺木耳的菌絲生長速度也明顯變慢。褐黃木耳(YUCM510207)分離自云南師宗五龍，五龍當地小氣候全年平均氣溫為18℃，屬于濕熱河谷，在35℃溫度下，該菌株生長也較緩慢。菌包上發(fā)育木耳的形態(tài)及出耳菌包見圖4、圖5。

表1 迪慶木耳耐高溫與其他菌株的對比及顯著性差異分析

菌株濃密度生長勢平均生長速度∕(cm∕6d)差異顯著性(0 05)迪慶黑木耳(YUCM510200)濃密++++6 93a栽培黑木耳(YUCM510072)濃+++4 54b版納毛木耳(YUCM510202)濃+++1 73c版納褐黃木耳(YUCM510206)濃++1 13d師宗褐黃木耳(YUCM510207)濃++1 13d版納皺木耳(YUCM510203)一般++1 05d

圖4 菌包上發(fā)育木耳的形態(tài)

圖5 出耳菌包

在迪慶經濟技術開發(fā)區(qū)潤達生物技術有限公司進行初步的小試栽培實驗，鮮品的生物學效率約為130%，以干品計算，則每公斤培養(yǎng)料能產生100 g干木耳。栽培出來的黑木耳，保持了原生木耳的口味特點，只是在泡發(fā)時香氣較淡。栽培品種由于生長發(fā)育時間短，整個栽培周期只有3個～4個月時間，次生物質積累時間短，和野生、仿野生長達幾年的時間相比，是否是發(fā)育時間短導致次生物質積累不夠多，尚未確定。

3 結論

迪慶金江木耳是1個薄片型、菊花狀的木耳，是1個耐高溫品種，可以進行人工栽培。人工栽培的木耳品質基本達到了和仿野生栽培所產木耳相同的品質。環(huán)境溫度過高是多種食用菌產業(yè)發(fā)展的重要制約因素，本文描述的木耳品種能在極高的環(huán)境溫度下正常生長、出耳，品質優(yōu)良，產量也較好，為在高溫地區(qū)發(fā)展木耳產業(yè)提供了菌種資源。

[1] 中國新聞網. 香格里拉發(fā)現千畝原生態(tài)木耳林[EBOL]. (2010-02-02). [2014-3-10]. http:finance.591hx.comarticle2010-02-02000025407s.shtml.

[2]陳劍山，鄭服從. ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應用[J]. 安徽農業(yè)科學，2007，35(13)：3785-3786．

[3]Looney B.P., Birkebak J.M., Matheny P.B.. Systematics of the genusAuriculariawith an emphasis on species from the Southeastern United States[J]. North American Fungi, 2013, 8(6):1-25.

[4]地圖在線. 金江鎮(zhèn)地圖[EBOL].(2012-02-10).[2014-2-18]. http:city.uemap.comjinjiang11.html.

Domestication ofAuriculariaauriculaProduced in Jinjiang Village in Diqing State of Yunnan Province

YANG Chun-yan1, ZHANG Zhao-bin2, WANG Xing-hong2

(1.Yunnan Open University, KunmingYunnan650500; 2.Institute of Microbiology of Yunnan University, KunmingYunnan650091)

Auriculariaauricula, called wood ear in China grown at Jinjiang village in Shangri-La County of Yunnan province, was cultivated extremely simple, extensive management with low yield, which was delicate and was sold in high price. In order to increase production and economic benefits, the colony (strain YUCM510200) was separated from the fruit body and was identified. The test of resistance to high temperature and cultivation experiment were done. The results showed that this strain was high temperature resistant, and the bud of wood ear was fast developed and formed compact. Wood ear piece was thin, and fruit body shape was mum. The inner surface was black, and the outer surface had fine hair. Appearance and taste of theAuriculariaauriculacultivated was same to that of bionics wild cultivation, but weak fragrance was present when ear piece was washed in water. Biological efficiency of per 1 kg dry fresh material can produce fresh 1 300 g or dry 100 g. This variety with the high temperature resistant had the value of popularization in the tropics.

Jinjiang village in Diqing State;Auriculariaauricula; Domestication

*項目來源：國家科技支撐計劃“云南天然橡膠產業(yè)關鍵技術研究與集成示范”(2011BAD30B00)；“云南微生物菌種資源標準化整理、共享及利用平臺建設”(2009DA002-3)；云南省教育廳科學研究基金項目“產生優(yōu)質血竭的龍血樹品種篩選”(2013C107)。

楊春燕(1969-)，女，副教授，主要從事應用微生物研究。E-mail: ychy933@163.com

2014-07-20

S646.6

A

1003-8310(2014)05-0014-03