郭 瑞，賈學(xué)淵，虞 泓，曾文波，陳自宏，楊俊媛

(云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實驗室，云南 昆明 650091)

羅伯茨蟲草及其無性型活性成分分析*

郭 瑞，賈學(xué)淵，虞 泓**，曾文波，陳自宏，楊俊媛

(云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實驗室，云南 昆明 650091)

以10株野生羅伯茨蟲草及其無性型羅伯茨被毛孢液體發(fā)酵菌絲體為研究對象，采用比色法和高效液相色譜法(HPLC)分別測定其多糖、甘露醇、尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷及蟲草素等活性成分含量，并與西藏那曲野生冬蟲夏草作比較。結(jié)果表明，羅伯茨蟲草尿嘧啶含量高于冬蟲夏草，尿苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷含量與冬蟲夏草接近，而多糖和蟲草素含量與冬蟲夏草差距較大。在10株羅伯茨被毛孢中，菌株HRT06的多糖、尿苷、鳥苷及腺苷含量最高，與其余菌株有顯著性差異(p<0.05)，且菌株HRT06的腺苷含量為0.140 mg·g-1，達到中國藥典冬蟲夏草腺苷含量不得少于0.100 mg·g-1的規(guī)定，可以篩選作為優(yōu)良菌株加以利用。本研究測定羅伯茨蟲草及其無性型羅伯茨被毛孢活性成分含量，為綜合評價羅伯茨蟲草應(yīng)用價值及其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

羅伯茨蟲草；羅伯茨被毛孢；多糖；甘露醇；核苷

羅伯茨蟲草Ophiocordycepsrobertsii(Hook.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones & Spatafora，為羅伯茨被毛孢寄生于蝙蝠蛾科幼蟲上形成的子座及幼蟲尸體復(fù)合體。本實驗室首次從羅伯茨蟲草中分離出羅伯茨蟲草無性型，經(jīng)分子和形態(tài)鑒定其為羅伯茨被毛孢Hirsutellarobertsii(Hook.)Hook，與冬蟲夏草無性型中國被毛孢HirsutellasinensisLiu,Guo,Yu & Zeng同屬于被毛孢屬Hirsutella，而羅伯茨被毛孢其生長速度及生物量優(yōu)于中國被毛孢。在系統(tǒng)地位上，羅伯茨蟲草和冬蟲夏草同屬于線蟲草屬Ophiocordyceps，且在多基因系統(tǒng)發(fā)育樹中與冬蟲夏草緊密聚為一支，表明羅伯茨蟲草和冬蟲夏草具有非常近的親緣關(guān)系[2]。羅伯茨蟲草作為冬蟲夏草近緣種，對其研究不僅能推動冬蟲夏草系統(tǒng)與進化研究，并且可以作為冬蟲夏草補充或替代資源，緩解人們對冬蟲夏草的需求壓力。

目前，國內(nèi)外對羅伯茨蟲草研究不多見，僅中國真菌志等少數(shù)幾篇文獻有所報道[1，3-7]，尚未見對羅伯茨蟲草活性成分和羅伯茨被毛孢活性成分的研究。本研究通過HPLC和比色法測定10株羅伯茨蟲草及其無性型羅伯茨被毛孢活性成分含量，與西藏那曲冬蟲夏草作比較，并篩選活性成分含量高的優(yōu)良菌株，為羅伯茨蟲草深入研究及其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試劑及儀器

1.1 試劑

多糖(110833-200904)、甘露醇(100533-201002)、尿嘧啶(100469-200401)、尿苷(110887-200202)、鳥苷(140631-200904)、腺嘌呤(110886-200001)、腺苷(110879-200202)和蟲草素(110858-200202)標準品，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純。

1.2 儀器

戴安ULTIMATE 3000高效液相色譜儀：LPG-3400A 四元梯度泵、WPS-3000SL自動進樣器、PDA-3000二極管陣列檢測器、TCC-3000柱溫箱、戴安原裝ACCLAIM C18色譜柱、5 μm，4.6000 mm×250 mm，“變色龍”(Chromeleon 6.80)控制分析色譜工作站軟件；高速萬能粉碎機FW-100，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；北京普析T-6紫外可見分光光度計。

1.3 材料

本試驗材料羅伯茨蟲草采自云南省昭通市水富縣銅鑼壩國家森林公園(表1)，根據(jù)形態(tài)、ITS及多基因分子系統(tǒng)分析，鑒定為Ophiocordycepsrobertsii(Hook.)G.H.Sung,J.M.Sung，Hywel-Jones & Spatafora。本研究菌株分離自羅伯茨蟲草，根據(jù)形態(tài)、ITS及多基因分子系統(tǒng)分析，鑒定為Hirsutellarobertsii(Hook.)Hook，為羅伯茨蟲草無性型。冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones & Spatafora采自西藏那曲。

表1 本研究實驗材料來源

1.4 樣品的制備

分別從10株不同羅伯茨新鮮蟲草樣品的菌核或子實體中分離出羅伯茨被毛孢菌株，菌株編號為HRT01～HRT10，在固體PPDA培養(yǎng)基上，18℃活化培養(yǎng) 60 d，取 1 cm2大小的菌塊放入含 100 mL 液體PPDA培養(yǎng)基的三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 r·min-1的搖床上18℃恒溫搖菌培養(yǎng) 21 d，再靜止培養(yǎng) 60 d。將三角瓶中的菌絲體取出，40℃恒溫干燥，粉碎至80目待用。將分離菌種后的野生羅伯茨蟲草分別標記為ORT01～ORT10，40℃恒溫干燥，粉碎至80目待用。冬蟲夏草40℃恒溫干燥，粉碎至80目待用。

2 試驗方法

2.1 多糖含量測定方法

稱取蟲草粉 0.100 g，90℃水浴熱回流 2 h，冷卻后用濾紙過濾，蒸餾水定容至 50 mL。吸取定容好的溶液 20 mL，70℃水浴揮干，加 1 mL 蒸餾水溶解，再加 5 mL 無水乙醇，4 000 r·min-1離心 15 min，棄上清液，加 1 mL 蒸餾水將沉淀徹底溶解，重復(fù)3次。最后加水將沉淀溶解并定溶至 50 mL。取溶液 2 mL，加入質(zhì)量分數(shù)為5%苯酚溶液 1 mL，迅速加入 7 mL 濃硫酸，然后40℃水浴 30 min，冰浴 5 min，降至室溫后用紫外分光光度計在 490 nm 處測定其吸光度，以蒸餾水代替供試品溶液，同樣方法制作空白對照[8，9]。

2.1.1 多糖標準曲線

分別制備質(zhì)量濃度為10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1的多糖標準品溶液，按多糖含量測定方法操作，以蒸餾水代替標準品溶液同樣方法制作空白對照，490 nm 處測定吸光度。以多糖標準品溶液質(zhì)量濃度Y為縱坐標，吸光度A為橫坐標繪制標準曲線，求出回歸方程為Y=73.502X+1.5366，r=0.9994，線性范圍為10 μg·mL-1～50 μg·mL-1。

2.2 甘露醇含量測定方法

精密稱取蟲草粉 0.100 g，加入 20 mL 蒸餾水，90℃水浴熱回流 2 h，冷卻后濾紙過濾，蒸餾水定容至 50 mL。取溶液 1 mL，加入 1 mL 高碘酸鉀溶液，再加入質(zhì)量分數(shù)為0.1% 的L-鼠李糖 2 mL 和新鮮配制的NaSh溶液 4 mL，53℃水浴加熱 15 min，顯色后冷卻至室溫，412 nm 處測定溶液吸光度。以蒸餾水代替供試品溶液，同樣方法制備空白對照[10，11]。

2.2.1 甘露醇標準曲線

分別制備質(zhì)量濃度為20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1、60 mg·L-1的甘露醇標準溶液，按“甘露醇含量測定方法”分別操作，以蒸餾水代替標準品溶液同樣方法制作空白對照，在 412 nm 處分別測定吸光度。以甘露醇質(zhì)量濃度Y為縱坐標，吸光度X為橫坐標繪制標準曲線，求出回歸方程為Y=59.535X+2.1864，r=0.9991，線性范圍為20 μg·mL-1～60 μg·mL-1。

2.3 羅伯茨蟲草核苷類成分測定(HPLC)

精密稱取蟲草粉 0.100 g，置于 5 mL 離心管中，加入質(zhì)量分數(shù)為20%的甲醇溶液 2 mL，超聲 90 min，放置至室溫，用 0.450 μm 微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液，注入高效液相色譜儀中檢測。

2.3.1 色譜條件

流動相：甲醇-水為流動相(15∶85)；流速：1.000 mL·min-1；檢測波長：260 nm；柱溫：30℃。該色譜條件下，8種核苷類峰圖與相鄰色譜峰均基線分離[12-16]。

2.3.2 線性關(guān)系的制備

精密稱取干燥至恒重的標準品，尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷和蟲草素(3’-脫氧腺苷)各3.000 mg，分別用質(zhì)量分數(shù)為20%的甲醇溶解定容至100 mL。

分別精密吸取混合對照品溶液5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積Y為縱坐標，以對照品質(zhì)量濃度X為橫坐標，計算回歸方程。線性范圍均為0.150 μg·mL-1～3.000 μg·mL-1，尿嘧啶：Y=75.724X+0.1782，r=0.9999；尿苷：Y=52.991X-0.1546，r=0.9996；鳥苷：Y=37.339X-0.0381，r=0.9996；腺嘌呤：Y=90.441X-0.3028，r=0.9999；腺苷：Y=54.827X+0.0235，r=0.9995；蟲草素：Y=67.471X-0.0627，r=0.999 7。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜圖

本研究中核苷類標準品、羅伯茨蟲草、羅伯茨被毛孢的HPLC圖見圖1～圖3。

注：1為尿嘧啶Uracil；2為尿苷Uridine；3為鳥苷Guanosine；4為腺嘌呤Adenine；5為腺苷Adenosine；6為蟲草素Cordycepin。

注：1為尿嘧啶Uracil；2為尿苷Uridine；3為鳥苷Guanosine；4為腺嘌呤Adenine；5為腺苷Adenosine；6為蟲草素Cordycepin。

注：1為尿嘧啶Uracil；2為尿苷Uridine；3為鳥苷Guanosine；4為腺嘌呤Adenine；5為腺苷Adenosine。

由圖1～圖3可以看出，在該色譜條件下，各成分波峰均基線分離。羅伯茨被毛孢波峰圖在 15 min 處沒有波峰，因此不含蟲草素。

3.2 測定結(jié)果與分析

羅伯茨蟲草和冬蟲夏草活性成分測定結(jié)果見表2。

由表2可知，羅伯茨蟲草含有的主要活性成分種類與冬蟲夏草相同，其中，羅伯茨蟲草尿嘧啶含量高于冬蟲夏草；尿苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷含量與冬蟲夏草接近，但多糖和蟲草素含量與冬蟲夏草差距較大。羅伯茨被毛孢活性成分測定結(jié)果見表3。

如表2、表3可知，除多糖外，羅伯茨蟲草主要活性成分含量都高于羅伯茨被毛孢。在10株羅伯茨被毛孢中，菌株HRT06的多糖、尿苷、鳥苷及腺苷含量為10株菌中最高，且是10株菌中唯一腺苷含量達到中國藥典冬蟲夏草規(guī)定(腺苷含量不得少于0.100 mg·g-1)的菌株。菌株HRT01甘露醇含量最高，菌株HRT02尿嘧啶和腺嘌呤含量最高。

3.3 HRT06菌株與其余菌株多糖、尿苷、鳥苷及腺苷含量比較

利用spss統(tǒng)計軟件，對羅伯茨被毛孢菌株HRT06和其余9株菌的多糖、尿苷、鳥苷及腺苷含量進行多重比較。比較結(jié)果見表4。

由表4可見菌株HRT06與菌株HRT01、HRT05多糖含量相比差異顯著(p<0.05)，與其余7株菌株多糖含量相比差異極顯著(p<0.01)；菌株HRT06尿苷、鳥苷、腺苷含量與其余9株菌含量相比差異極顯著(p<0.01)。

4 討論

本研究中羅伯茨蟲草主要分布于云南省昭通市水富縣銅鑼壩國家森林公園，其環(huán)境為亞熱帶常綠闊葉林，具有生物多樣性豐富，雨水充足，溫度適宜等特點[17]。蟲草主要活性成分有多糖、甘露醇、腺苷、蟲草素等，其中多糖具有提高機體免疫能力，抗疲勞、抗腫瘤，降低血膽固醇等功效[18-20]；甘露醇具有利尿脫水、鎮(zhèn)咳祛痰、平喘等多種功效[21，22]；腺苷具有促進細胞分化，改善心腦血液循環(huán)，抑制蛋白質(zhì)激酶和反轉(zhuǎn)錄酶活性等功效；蟲草素具有抑制腫瘤，抗病毒，免疫調(diào)節(jié)和降血糖等功效[23-27]。蟲草主要活性成分含量的高低已成為蟲草產(chǎn)品的質(zhì)控指標之一，因此通過對蟲草主要活性成分含量的檢測，可以為蟲草內(nèi)在品質(zhì)的評價提供科學(xué)依據(jù)。

表2 羅伯茨蟲草和冬蟲夏草活性成分測定結(jié)果

表3 羅伯茨被毛孢活性成分測定結(jié)果

表4 HRT06菌株與其余菌株多糖、尿苷、鳥苷及腺苷含量比較結(jié)果a

注：a為多重比較結(jié)果；無*表示無統(tǒng)計學(xué)差異，*表示差異達到0.05顯著水平，**表示差異達到0.01極顯著水平。

本研究首次測定羅伯茨蟲草及其無性型羅伯茨被毛孢的主要活性成分含量，研究發(fā)現(xiàn)，羅伯茨蟲草主要活性成分種類與冬蟲夏草相同；羅伯茨蟲草中含有蟲草素，但羅伯茨被毛孢中不含蟲草素，其原因還需做下一步研究。羅伯茨蟲草尿嘧啶含量高于冬蟲夏草、尿苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷含量，與冬蟲夏草接近，而多糖和蟲草素含量與冬蟲夏草差距較大。在10株羅伯茨被毛孢中，菌株HRT06多糖、尿苷、鳥苷及腺苷含量為10株菌中最高，且與其余9株菌株含量相比差異顯著(p<0.05)。菌株HRT06是10株菌中唯腺苷含量達到中國藥典冬蟲夏草規(guī)定腺苷含量不得少于0.100 mg·g-1的菌株[23]，因此菌株HRT06為羅伯茨被毛孢優(yōu)良菌株，可用于規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)。

目前，羅伯茨蟲草還處于未開發(fā)階段，具有較好的開發(fā)利用潛力。本研究所篩選的羅伯茨被毛孢優(yōu)良菌株HRT06，生長速度及生物量都優(yōu)于中國被毛孢，具有潛在應(yīng)用和經(jīng)濟價值。因此羅伯茨蟲草可以作為冬蟲夏草補充或替代資源，緩解人們對冬蟲夏草的需求壓力。

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Analysis on Active Components ofOphiocordycepsrobertsiiand Its AnamorphHirsutellarobertsii

GUO Rui, JIA Xue-yuan, YU Hong, ZENG Wen-bo, CHEN Zi-hong, YANG Jun-yuan

(Yunnan Herbal Laboratory, Institute of Herb Biotic Resources, Yunnan University, KunmingYunnan650091)

In this study, the ten samples of wildOphiocordycepsrobertsiiand their mycelia ofHirsutellarobertsiistrains by liquid fermentation were detected in order to analyze the active components. The contents of polysaccharide, mannitol, uracil ,uridine, guanosine, adenine, adenosine, cordycepin were determined by colorimetry and HPLC, comparing wildOphiocordycepssinensisfrom Naqu of Tibet. The results indicated that the contents of uracil inO.robertsiiwere higher than that ofO.sinensis,and the contents of uridine, guanosine, adenine and adenosine were close to those ofO.sinensis. However, the contents of polysaccharide and cordycepin inO.robertsiiwere lower than those ofO.sinensis. The strain HRT06 ofH.robertsiihad the highest contents of polysaccharide, uridine,guanosine and adenosine among the ten strains ofH.robertsii.In addition, the adenosine content of strain HRT06 was 0.140 mg·g-1,which was higher than the quality standard (0.100 mg·g-1) ofO.sinensisin Chinese Pharmacopoeia.Therefore, the strain HRT06 was selected as an excellent strain with high yield to ferment mycelia at scale.The conclusion could provide scientific basis for evaluating the potential value ofO.robertsiiandH.robertsii, and exploiting their economic and pharmaceutical values.

Ophiocordycepsrobertsii;Hirsutellarobertsii;Polysaccharide;Mannitol;Nucleoside

*項目來源：國家教育部博士點基金項目“冬蟲夏草復(fù)合體種群DNA序列生態(tài)地理變異式樣研究”(20125301110001)；云南省基礎(chǔ)應(yīng)用研究重點項目“云南蟲草遺傳資源及其開發(fā)利用研究”(2008CC019)。

郭瑞(1989-)，男，在讀碩士研究生，主要從事蟲草真菌分類及開發(fā)利用研究。E-mail∶414621016@qq.com

**通信作者： 虞泓，教授，主要從事蟲草資源遺傳與利用研究。E-mail∶hongyu@ynu.edu.cn或herbfish@163.com

2014-06-20

S646.9

A

1003-8310(2014)05-0054-05