黃 鶯，徐 芳，萬 勇，孫潔民，李劍平

（湖北省武漢市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430022）

◇藥學研究◇

雷帕霉素對肺間質(zhì)纖維化大鼠IL-17、IL-2、TGF-β 和IL-6及調(diào)節(jié)性T細胞的影響

黃 鶯，徐 芳，萬 勇，孫潔民，李劍平

（湖北省武漢市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430022）

目的 研究雷帕霉素對大鼠肺纖維化的影響及其機制。方法 SD大鼠15只，隨機分為博來霉素5只，生理鹽水對照組5只，雷帕霉素干預(yù)組5只。采用氣管內(nèi)注入博來霉素（5 mg·kg-1）的方法復(fù)制大鼠肺纖維化模型。對照組采用氣管內(nèi)注入生理鹽水（1.25 mL·kg-1）的方法制造陰性對照。氣管灌注博來霉素后第3天給予雷帕霉素干預(yù)組大鼠雷帕霉素灌胃（每天1 mg·kg-1），連續(xù)10 d達到雷帕霉素對肺纖維化的干預(yù)。第28天分別處死動物，肺組織病理切片 HE染色，免疫組織化學方法檢測 IL-17、IL-2、TGF-β和 IL-6的表達；流式細胞術(shù)檢測 CD4+調(diào)節(jié)性 T細胞和 CD8+調(diào)節(jié)性 T細胞的比例。結(jié)果 雷帕霉素干預(yù)組肺纖維化嚴重程度較博來霉素組明顯減輕，Ashcroft評分存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；IL-6、IL-17、TGF-β和 IL-2表達水平在博來霉素組較正常對照組和雷帕霉素干預(yù)組升高（P＜0.01）。雷帕霉素組的 IL-17、TGF-β的表達水平較對照組升高（P＜0.01），但是較博來霉素組降低（P＜0.01）。各組總體樣本數(shù)據(jù)行相關(guān)分析提示 IL-6和 IL-17表達水平具有正相關(guān)性，IL-17與 TGF-β表達水平也具有正相關(guān)性。雷帕霉素干預(yù)組 CD4+CD25+Foxp3+細胞占 CD4+CD25+細胞、CD4+細胞和淋巴細胞百分比較對照組升高，CD8+CD25+Foxp3+細胞的相關(guān)比例也較對照組和博來霉素組升高，并具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。博來霉素組 CD8+CD25+Foxp3+細胞占 CD8+CD25+細胞百分比較對照組高，并具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。結(jié)論 雷帕霉素具有抑制肺纖維化的作用，其抗纖維化的作用可能通過促進調(diào)節(jié)性 T細胞作者：雨林木風的誘導(dǎo)增殖及其對Th17細胞等效應(yīng)性細胞的抑制作用發(fā)揮來實現(xiàn)。

博來霉素；雷帕霉素；調(diào)節(jié)性 T細胞；肺纖維化

近期有文獻指出調(diào)節(jié)性 T細胞在肺纖維化患者中，不僅存在數(shù)量的下降，同時伴有其抑制效應(yīng)型T細胞分泌炎性因子功能的下降，最終導(dǎo)致肺纖維化患者調(diào)節(jié)性 T細胞抑制功能的不足［1］。我們認為肺纖維化作為一種伴有自身免疫紊亂的疾病，也可能存在調(diào)節(jié)性 T細胞和Th17細胞的不平衡。

雷帕霉素是一種新型的免疫抑制藥物，屬于大環(huán)內(nèi)酯類藥物，近期有研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對調(diào)節(jié)性T細胞例外，具有增強外周和胸腺幼稚 T細胞Foxp3的表達水平的作用［2］。說明雷帕霉素具有擴增調(diào)節(jié)性T細胞的作用。那么雷帕霉素是否具有確切的抗肺纖維化的作用，其是否通過對調(diào)節(jié)性T細胞的擴增達到控制肺纖維化的作用呢。我們針對此問題展開了研究工作，取得了重要的發(fā)現(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 材料 15只體重在180～200 g的健康 SPF級雌性 SD大鼠，購自武漢大學動物中心。eBioscience公司流式抗體（CD4-FITC、CD8-FITC、CD25-PE、Foxp3-PE-Cy5、Foxp3 Staining Buffer Set）、santa cruz biotechnology公司免疫組化一抗抗體（IL-17、TGFβ1、IL-6、IL-2）、抗兔二抗（購自DAKO公司，針對IL-2、IL-17、TGF-β三種一抗，貨號 K5007）、抗羊二抗（購自 KPL公司公司，針對IL-6一抗）。博來霉素（天津太和制藥有限公司，每支4 mg）紅細胞裂解液 （Beckman Coulter公司PN A11894）、雷帕霉素100 mg（上海源葉生物科技公司 貨號53123-88-9）。

1.2 動物分組和處理 SD大鼠15只，隨機分為博來霉素5只，生理鹽水對照組5只，雷帕霉素干預(yù)組5只。采用氣管內(nèi)注入博來霉素（5 mg·kg-1）的方法復(fù)制大鼠肺纖維化模型［3］。對照組采用氣管內(nèi)注入生理鹽水（1.25 mL·kg-1）的方法制造陰性對照。氣管灌注博來霉素后第3天給予雷帕霉素干預(yù)組大鼠雷帕霉素灌胃（每天 1 mg·kg-1）［4］，連續(xù)10 d達到雷帕霉素對肺纖維化的干預(yù)。造模 28 d期滿后處死全部大鼠，水合氯醛麻醉大鼠后，取外周血3 mL，于左側(cè)肺下葉相同部位的肺組織取材進行常規(guī)包埋，石蠟切片。

1.3 肺組織切片 HE染色和免疫組織化學檢查制成5 μm厚度的石蠟切片。用蘇木素染色液染細胞核3 min，流水洗，鹽酸酒精分化，流水洗，氨水返藍30 s，蒸餾水洗，顯微鏡下觀察染色情況。酒精伊紅染細胞質(zhì)15 s。染色后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。并在顯微鏡下對肺間質(zhì)的厚度和肺纖維化的范圍進行觀察。分別對 IL-2、IL-17、IL-6、TGF-β1在肺組織內(nèi)的表達。

1.4 流式細胞術(shù)檢測 通過貝克曼流式細胞儀進行檢測。以 FSC-SSC散點圖設(shè)定淋巴細胞。然后以 CD4-FITC和 SSC設(shè)定 CD4+T淋巴細胞門 N。以 CD4+淋巴細胞門N為門選取CD25+CD4+雙陽性細胞，并以此 CD25+CD4+雙陽性細胞為門 L2。以 CD25+CD4+雙陽性細胞為門 L2選取CD4+CD25+Foxp3+三陽性細胞。通過以上設(shè)定，算出CD4+CD25+淋 巴 細 胞／CD4+淋 巴 細 胞、CD4+CD25+Foxp3+淋巴細胞／CD25+CD4+淋巴細胞、CD4+CD25+Foxp3+淋巴細胞／CD4+淋巴細胞比例。同樣 CD8+CD25+淋巴細胞／CD8+淋巴細胞、CD8+CD25+Foxp3+淋巴細胞／CD25+CD8+淋巴細胞、CD8+CD25+Foxp3+淋巴細胞／CD8+淋巴細胞比例也通過類似設(shè)定檢測。

1.5 圖像分析 石蠟切片 HE染色完成后，以 Ashcroft評分評估肺纖維化的程度。免疫組織化學染色完成后，每張切片選取 5個肺間質(zhì)相似區(qū)域，在400倍放大的高倍視野下通過顯微鏡拍照取圖，每次取圖保持顯微鏡光源強度和顯微鏡放大倍數(shù)保持恒定。通過image-pro plus分析軟件對每張圖片根據(jù)免疫組化陽性著色的深淺及其陽性面積范圍計算視野下的積分光密度。每張切片所有視野的積分光密度取平均值作為該張切片的積分光密度。以積分光密度作為評估目標蛋白表達強弱的指標。

1.6 統(tǒng)計學分析 各組大鼠 Ashcroft評分因方差不齊，采用 Kruskal-wallis法進行總體分布統(tǒng)計學分析，使用Nemenyi進行兩兩比較。3組大鼠的 IL-17和 TGF-β積分光密度采用完全隨機設(shè)計的多個樣本方差分析，對各組間兩兩比較使用LSD-t檢驗；IL-6和 IL-2不符合方差齊性數(shù)據(jù)采用各組總體均數(shù)比較采用Kruskal-wallis法進行統(tǒng)計學分析。CD8+%數(shù) 據(jù) 經(jīng) 過 檢 測不 符 合 方差 齊 性，采 用Kruskal-wallis法進行統(tǒng)計學分析；其余各組流式細胞學檢測數(shù)據(jù)滿足方差齊性，采用單因素方差分析，對各組間兩兩比較使用 LSD-t檢驗。數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準誤表達，以P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。對免疫組化各細胞因子表達水平之間的關(guān)系，采用Pearson積差相關(guān)分析。以上數(shù)據(jù)處理均通過SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學變化 正常對照組肺臟組織行切片HE染色發(fā)現(xiàn)，肺泡間隔正常，肺泡的連續(xù)性未受到破壞，肺泡的直徑和面積大小均勻，大部分區(qū)域終末小氣道及血管周邊無明顯炎性侵潤表現(xiàn)，有少數(shù)個別區(qū)域終末小氣道管壁有增厚現(xiàn)象及少許炎性侵潤表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)纖維化形成。博來霉素組肺泡間隔增寬，肺泡的連續(xù)性受到破壞，肺泡的直徑和面積大小不均勻，終末小氣道周邊炎性細胞侵潤明顯，血管周邊也發(fā)現(xiàn)明顯的炎性細胞侵潤現(xiàn)象。同時伴有纖維化形成，以支氣管周邊區(qū)域較為明顯，外周局部區(qū)域也有局灶性的纖維化表現(xiàn)。雷帕霉素組終末小氣道周邊仍有炎性細胞侵潤，血管周邊也有炎性細胞侵潤現(xiàn)象，但較博來霉素組明顯減輕，未發(fā)現(xiàn)纖維化形成（見圖 1）。參照文獻實行Ashcroft評分結(jié)果如下，對照組：0.28±0.45，博來霉素組：5.76±1.76，雷帕霉素組：2.92±0.64。對各組 Ashcroft評分進行統(tǒng)計學分析，經(jīng)過方差齊性檢測發(fā)現(xiàn)方差不齊，采用 Kruskal-wallis法進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示四組大鼠評分結(jié)果具有統(tǒng)計學差異，P＜0.01。并參照文獻使用 Nemenyi進行兩兩分析，結(jié)果顯示：雷帕霉素干預(yù)組評分與正常對照組有統(tǒng)計學差異，P＜0.01，但較博來霉素組明顯減低，P＜0.01。

2.2 肺組織免疫組織化學結(jié)果 白介素 IL-17表達：博來霉素組所表達量最高，對照組所表達的白介素17的量最低，其次是雷帕霉素干預(yù)組；雷帕霉素組和對照組表達量具有統(tǒng)計學差異；雷帕霉素組白介素17表達量較博來霉素組低，具有統(tǒng)計學差異，見圖2。

白介素 IL-6表達：博來霉素組表達最高，對照組所表達的 IL-6的量最低，其次是雷帕霉素干預(yù)組；雷帕霉素組和對照組表達量不具有統(tǒng)計學差異；雷帕霉素組 IL-6表達量較博來霉素組低，具有統(tǒng)計學差異，見圖3。

白介素 IL-2表達：博來霉素組所表達量高；對照組所表達的 IL-2的量最低，其次是雷帕霉素干預(yù)組，雷帕霉素組和對照組表達量不具有統(tǒng)計學差異；雷帕霉素組 IL-2表達量較博來霉素組低，具有統(tǒng)計學差異，見圖4。

TGF-β表達：博來霉素組所表達量最高；對照組所表達的白介素TGF-β的量最低，其次是雷帕霉素干預(yù)組，雷帕霉素組和對照組表達量具有統(tǒng)計學差異；雷帕霉素組白介素 TGF-β表達量較博來霉素組低，具有統(tǒng)計學差異，見圖5。

2.3 流式細胞術(shù)結(jié)果 雷帕霉素干預(yù)組 CD4+CD25+Foxp3+細胞占 CD4+CD25+細胞、CD4+細胞和淋巴細胞百分比較對照組和博來霉素組升高，雷帕霉素干預(yù)組 CD8+CD25+Foxp3+細胞的比例也較對照組和博來霉素組有提升，并具有統(tǒng)計學差異。博來霉 素 組CD8+CD25+Foxp3+細 胞 占 CD8+CD25+細胞百分比較對照組高，并具有統(tǒng)計學差異。博來霉素組 CD4+CD25+Foxp3+細胞占 CD4+細胞、CD4+CD25+細胞及淋巴細胞的百分比較正常對照組無統(tǒng)計學差異，見表1。

圖1 各組肺組織免疫組化 HE染色 ×100

圖2 各組 IL-17免疫組化表達 ×400

圖3 各組 IL-6免疫組化表達 ×400

圖4 各組 IL-2免疫組化表達 ×400

圖5 各組 TGF-β免疫組化表達 ×400

3 討論

雷帕霉素作為免疫抑制劑對于體內(nèi)多種 T細胞具有抑制增殖的作用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種自身免疫性疾病和器官移植后抗排斥反應(yīng)的治療［5-6］。其 作 用 機制 是 通過 與雷 帕 霉 素靶 蛋 白mTOR結(jié)合，阻斷效應(yīng)型T細胞的增殖［7］，我們的研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素干預(yù)組終末小氣道及血管周邊仍有炎性侵潤表現(xiàn)，但是較博來霉素組明顯降低，氣道周邊范圍肺泡間隔基本正常，肺泡的連續(xù)性基本未受到破壞，未發(fā)現(xiàn)纖維化形成。Ashcroft評分評估肺纖維化的程度，肺纖維化程度較博來霉素組明顯改善。目前國內(nèi)外也有研究者使用雷帕霉素對博來霉素所致大鼠肺纖維化進行干預(yù)［8］，其研究結(jié)果與我們相同。說明雷帕霉素具有抑制大鼠肺纖維化的作用，但是具體機制尚不明確。

表1 流式細胞術(shù)結(jié)果

有文獻指出，肺纖維化患者中存在調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量不足，并且具有對效應(yīng)性 T細胞抑制功能減弱的表現(xiàn)，動物實驗發(fā)現(xiàn)，對大鼠調(diào)節(jié)性T細胞進行擴增，能夠降低大鼠肺纖維化的程度［1，9］。說明調(diào)節(jié)性 T細胞可能具有抑制肺纖維化的作用。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)博來霉素組大鼠發(fā)生明顯肺纖維化，其IL-17表達水平明顯升高，與正常對照組具有明顯統(tǒng)計學差異；但是其調(diào)節(jié)性T細胞所占比例較正常對照組卻沒有統(tǒng)計學差異，其CD8+Treg%較正常對照組高，但是其總的數(shù)量卻較正常組無統(tǒng)計學差異。這就說明在博來霉素干預(yù)組大鼠中存在Th17細胞功能數(shù)量明顯上升的同時，調(diào)節(jié)性 T細胞的數(shù)量卻無明顯提升，其功能和數(shù)量相對于Th17細胞是相對下降的。

國外研究發(fā)現(xiàn)對PI3K，Akt，mTOR通路信號關(guān)鍵分子的阻斷可以增強外周和胸腺幼稚T細胞Foxp3的表達水平［10］。我們實驗中的雷帕霉素干預(yù)組 CD4+調(diào)節(jié)性 T細胞和 CD8+調(diào)節(jié)性T細胞的比例也較對照組和博來霉素組具有明顯提升，說明雷帕霉素通過與雷帕霉素靶蛋白 mTOR結(jié)合，具有提高調(diào)節(jié)性 T細胞數(shù)量，并通過提高調(diào)節(jié)性 T細胞數(shù)量和功能抑制肺纖維化病情發(fā)展。

我們的研究結(jié)果顯示博來霉素組上述幾個細胞因子的表達水平較對照組升高，通過對各項指標的數(shù)據(jù)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，IL-6和 IL-17的表達水平具有線性正相關(guān)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在IL-6和 TGF-β協(xié)同下，可以促使幼稚 T細胞向Th17方向分化，從而減少向調(diào)節(jié)性 T細胞方向分化［11］。而IL-17對 IL-6的表達具有誘導(dǎo)作用［12］，同時有文獻指出IL-6具有對肺纖維化內(nèi)的成纖維細胞的凋亡抑制的作用，而成纖維細胞通過分泌 IL-6提升 IL-6的表達水平［13］。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們推測 IL-6及分泌 IL-6的細胞、成纖維細胞、和 Th17細胞之間存在正反饋循環(huán)。這個正反饋循環(huán)不僅使調(diào)節(jié)性 T細胞和效應(yīng)型 T細胞功能數(shù)量失衡并促進病灶內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，同時加速成纖維細胞在病灶內(nèi)聚集和異常表型的轉(zhuǎn)化。本研究中的雷帕霉素干預(yù)組 IL-17、IL-6、TGF-β、IL-2表達水平較博來霉素組明顯降低，說明雷帕霉素可能也通過提高調(diào)節(jié)性 T細胞數(shù)量發(fā)揮免疫抑制作用，直接抑制多種效應(yīng)型 T細胞，致使 IL-6、TGF-β、IL-2炎性因子的分泌減少，打破上述的多種細胞及多種細胞因子參與的正反饋過程，減少成纖維細胞在病灶內(nèi)聚集和表型轉(zhuǎn)化，達到抑制肺纖維化的目的。

總之，肺纖維化的發(fā)病機制目前尚未完全明確，治療手段也相對匱乏。我們的研究結(jié)果顯示雷帕霉素具有抑制肺纖維化的作用，其抗纖維化的作用可能通過促進調(diào)節(jié)性 T細胞的誘導(dǎo)增殖及其對Th17細胞等效應(yīng)性細胞的抑制作用來實現(xiàn)。

［1］ 梅 楊，葛 銳，潘發(fā)明，等.調(diào)節(jié)性 T細胞與常見自身免疫性疾?。跩］.安徽醫(yī)藥，2010，14（3）：249-252.

［2］ Ogino H，Nakamura K，Iwasa T，et al.Regulatory T cells expanded by rapamycin in vitro suppress colitis in an experimental mouse model［J］.J Gastroenterol，2011，47（4）：366-376.

［3］ Gao J，Huang Y，Li P，et al.Antifibrosis effects of total glucosides of Danggui-Buxue-Tang in a rat model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis［J］.Ethnopharmacol，2011，136（1）：21-26.

［4］ Yoshizaki A，Yanaba K.Treatment with rapamycin prevents fibrosis in tight-skin and bleomycin-induced mouse models of systemic sclerosis［J］.Arthritis Rheum，2010，62（8）：2476-2487.

［5］ Ozdemir BH，Ozdemir AA，Erdal R，et al.Rapamycin prevents interstitial fibrosis in renal allografts through decreasing angiogenesis and inflammation［J］.Transplant Proc，2011，43（2）：524-526.

［6］ 彭磊磊，葛圣林，張成鑫.不同劑量雷帕霉素對小鼠體內(nèi) CD4+ CD25+Treg細胞的影響［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15（3）：284-286.

［7］ Julien LA，Roux PP.mTOR，the mammalian target of rapamycin ［J］.Med Sci（Paris），2010，26（12）：1056-1060.

［8］ Korfhagen TR，Le Cras TD，Davidson CR，et al.Rapamycin prevents transforming growth factor-alpha-induced pulmonary fibrosis［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2009，41（5）：562-572.

［9］ Trujillo G，Hartigan AJ，Hogaboam CM.T regulatory cells and attenuated bleomycin-induced fibrosis in lungs of CCR7-／-mice ［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2010，3：18.

［10］Ogino H，Nakamura K，Iwasa T，et al.Regulatory T cells expanded by rapamycin in vitro suppress colitis in an experimental mouse model［J］.J Gastroenterol，2012，47（4）：366-376.

［11］潘 瑞，潘家華.T效應(yīng)細胞通路在哮喘發(fā)病機制中的研究進展及靶向治療前景［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15（4）：397-400.

［12］Severino VO，Napimoga MH，Pereira SA.Expression of IL-6，IL-10，IL-17 and IL-8 in the peri-implant crevicular fluid of patients with peri-implantitis［J］.Arch Oral Biol，2011，56（8）：823-828.

［13］Zhang J，F(xiàn)eng MX，Qu JM.Low Dose Theophylline Showed an Inhibitory Effect on the Production of IL-6 and IL-8 in Primary Lung Fibroblast from Patients with COPD［J］.Mediators Inflamm，2012，2012：492901.

Augmentation of IL-17，IL-2，TGF-β，IL-6 and CD4+CD25+Foxp3+Regulatory T Cells by rapamycin to repression of pulmonary fibrosis in rats

HUANG Ying，XU Fang，WAN Yong，et al
（Department of Respiratory Diseases，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan，Hubei 430022，China）

Objective To study the influence of rapamycin on pulmonary fibrosis in rats and its mechanism.Methods Pulmonary fibrosis model was induced by using the method of intratracheal instillation of bleomycin（5 mg·kg-1）.Control group was treated by intratracheal instillation of saline（1.25 mL·kg-1）to obtain the negative control.The rats of the rapamycin treated group were given rapamycin （1 mg·kg-1per day）by gastric perfusion for consecutive 10 days beginning on the third day after intratracheal instillation of bleomycin.On the day of 28th all rats were sacrificed and the peripheral blood and the lung tissues were harvested.The lung tissue were performed HE staining.And the severity of pulmonary fibrosis in rats was assessed by Ashcroft score.The lung tissues were performed immunohistochemical staining to detect the expression of IL-6，IL-17，TGF-beta and IL-2.The expression levels were judged by integrated optical density.Flow cytometry was used to detect the percentages of CD4+CD25+Foxp3+T cells，CD8+CD25+Foxp3+T cells.Results The severity of pulmonary fibrosis was improved in rats of rapamycin group，compared with the rats of bleomycin group.And there was significant difference in Ashcroft score（P＜0.01）between rapamycin group and bleomycin group.The expression levels of IL-6，IL-17，TGF-β and IL-2 increased in bleomycin group，compared with the normal control group.The expression levels of IL-6，IL-17，TGF-β and IL-2 decreased in rapamycin group，compared with the bleomycin group.Correlation analysis for data suggested a positive correlation between IL-6 and IL-17 expression levels.And the expression levels of IL-17 were positive correlated with TGF-β.The percentages of CD8+CD25+Foxp3+T cells and CD4+CD25+Foxp3+T cells increased in rapamycin group，compared with the normal control group and bleomycin group.Conclusions Rapamycin can prevent bleomycin-induced pulmonary fibrosis，and its antifibrotic effect maybe works by the promotion of proliferation and function of regulatory T cells and the inhibition of proliferation and function of Th17 cells.

bleomycin；rapamycin；regulatory T cell；pulmonary fibrosis

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.006

2013-09-19，

2013-10-29）

武漢市科技攻關(guān)計劃資助項目（No 200751099415）

徐 芳，女，副主任醫(yī)師，研究方向：肺間質(zhì)纖維化，Email：xf-0526＠sina.com