高 路, 何聰芬,*, 李 萌, 張昕悅

(1.北京工商大學北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室,北京 100048;2.河北聯(lián)合大學生命科學學院,河北唐山 063000)

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是食品、醫(yī)院內(nèi)感染以及化妝品領(lǐng)域重要的致病菌之一[1].金黃色葡萄球菌腸毒素現(xiàn)已成為世界性衛(wèi)生問題,根據(jù)美國疾病預防控制中心報告,在美國整個細菌性食物中毒中由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的為33%,加拿大更多,為45%,其他一些歐洲國家如芬蘭、匈牙利等占50%以上.我國每年由于金黃色葡萄球菌引起的中毒事件也非常多[2].由于抗生素的大量使用,促進了耐藥性菌株的不斷出現(xiàn),尤其是耐甲氧西林菌,其中就包括了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA).因此建立MRSA的檢測方法,對控制MRSA的感染是十分重要的.

1 傳統(tǒng)檢測方法

傳統(tǒng)方法[1,3]檢測金黃色葡萄球菌主要通過富集培養(yǎng)、分離純化培養(yǎng)、菌落的形態(tài)觀察和一系列的生化鑒定以及血清型鑒定等步驟進行檢測,檢測過程需時大概4～7 d,步驟煩瑣.臨床上MRSA的檢測最常采用的是傳統(tǒng)的藥物敏感試驗方法,其中包括藥敏紙片法、β-內(nèi)酰胺酶檢測、苯唑西林鹽瓊脂篩查法、E-test和試管雙倍稀釋法等.但是MRSA的檢出很容易受到培養(yǎng)基成分,特別是氯化鈉含量、pH值、孵育時間、接種量、溫度以及培養(yǎng)基中是否加誘導劑等多種因素影響,方法比較費時,并且使用方法不當時,容易造成漏檢或誤檢.

2 快速檢測方法

近幾年來,金黃色葡萄球菌的快速檢測及其自動化研究進展迅速.目前,國內(nèi)外針對金黃色葡萄球菌檢測方法分為生化檢測、免疫學檢測以及分子生物學檢測3個方面.

2.1 生化檢測

2.1.1 顯色培養(yǎng)基

1974年,Alain研發(fā)了用于檢測大腸桿菌的顯色培養(yǎng)基并于1979年申請專利,成立了法國科瑪嘉公司.顯色培養(yǎng)基的原理是利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應顯色底物反應顯色來檢測微生物的新型培養(yǎng)基.顯色培養(yǎng)基是將目標微生物特征酶加入到選擇培養(yǎng)基中,將微生物的特征性酶的測試和選擇性培養(yǎng)同時進行.當目標微生物在培養(yǎng)基上選擇性的生長,其特征酶能夠降解顯色底物,并產(chǎn)生帶有特殊顏色的代謝產(chǎn)物,使得菌落呈現(xiàn)特定的顏色.與此同時干擾菌被抑制或者不產(chǎn)生特征酶而不顯色,通過顯色培養(yǎng)基上菌落顏色形態(tài)觀察或簡單試驗就可以進行鑒別.目前市場上比較成熟的金葡菌顯色培養(yǎng)基產(chǎn)品主要有CHROM agar Staph aureus(生產(chǎn)商:科瑪嘉公司),BBL CHROM agar Staph aureus(生產(chǎn)商:BD公司),S.aureus ID、3M Petrifilm Staph Express Countplate(生產(chǎn)商:生物梅利埃公司)等.

2.1.2 快速測試片

快速測試片是以紙膜、紙片、膠片等作為培養(yǎng)基的載體,將特定的顯色物質(zhì)和培養(yǎng)基附著在上面,通過微生物在上面的生長、顯色來檢測食品中微生物的一種快速檢測方法.

金黃色葡萄球菌的快速測試片既具有顯色培養(yǎng)基的靈敏、特異和高選擇性,并且具有紙片法的方便、經(jīng)濟與快捷的特點,特別適合于食品中金黃色葡萄球菌的快速初篩,可以滿足金黃色葡萄球菌快速檢測的需要.

2.2 免疫學方法

免疫分析方法是利用抗體與抗原特異性結(jié)合的特性實現(xiàn)樣品檢測的方法.此法具有較高的特異性和靈敏度,可有效避免復雜樣本中雜質(zhì)干擾,簡化了前處理凈化步驟.用于食品安全檢測的方法主要包括免疫凝聚和沉淀法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法等.

2.2.1 乳膠凝集法

1980年,Essers和 Radebold首先使用乳膠凝集的方法準確檢測金黃色葡萄球菌,此方法是基于特異性檢測凝固酶活性(凝集因子)和蛋白A.過去的30年中,基于這一原理已經(jīng)研制出許多商業(yè)化檢測金黃色葡萄球菌的乳膠凝集試劑盒.Griethuysen等[4]對892株金黃色葡萄球菌樣品采用乳膠凝集試劑盒進行檢測,結(jié)果顯示此方法的靈敏度和特異性分別為98.2%和98.9%,證實了乳膠凝集試劑盒能夠有效地檢測金黃色葡萄球菌,但在一些MRSA菌株凝集檢測易出現(xiàn)假陰性.為了解決這一問題,研究人員開發(fā)了第三代金黃色葡萄球菌乳膠凝集檢測試劑盒,此試劑盒在原有的基礎(chǔ)上同時還檢測5型和8型莢膜多糖.近年來,為了進一步提高特異性,第四代乳膠凝集試劑盒Staph Plus Latex Kit(Dia-MondiaL[DML],See,France)問世.第四代乳膠凝集試劑盒是將開發(fā)的藍色羧基微粒與檢測凝固酶、蛋白A以及5型和8型莢膜多糖相結(jié)合.在靈敏度和特異性方面第四代乳膠凝集試劑盒能夠與第三代相媲美,且更易于鑒別金黃色葡萄球菌.

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是近年來應用較為廣泛的免疫學方法,其原理是將酶分子與抗體(抗原)分子相結(jié)合形成酶標記分子,這種酶標分子既具有免疫活性,又保留酶的活性.酶標記分子與固相免疫吸附劑中相應的抗原(抗體)或抗原抗體結(jié)合物相遇,形成了酶抗原抗體結(jié)合物,催化加入的底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物,可根據(jù)顏色反應的深淺進行檢測.它主要包括直接法、間接法、夾心法.ELISA法應用于檢測金黃色葡萄球菌腸毒素,國內(nèi)外有較多相關(guān)報道.隨著抗各型腸毒素單克隆抗體的成功制備,ELISA診斷試劑盒也已開始得到廣泛使用.

目前,美國食品和藥品管理局認可使用的金黃色葡萄球菌檢測ELISA方法主要有:TECRA(生產(chǎn)商:Bio enterprises Roseville,Australia),SET-EIA(生產(chǎn)商:Toxin Technology Madison,WI和Transia Lyon,France).

2.2.3 化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測法

1977年,Halman等創(chuàng)建化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA).CLEIA法是將化學發(fā)光法和免疫分析法相結(jié)合,其原理是根據(jù)化學發(fā)光的強度(RLU)與反應物(產(chǎn)物)的濃度呈正比來進行檢測.該方法既具有化學發(fā)光的高靈敏度,同時還具有免疫分析方法的高特異性,檢測的線性范圍寬,且簡單快速,無放射性污染.Creton等[5]實驗表明此方法的檢測靈敏度常高于放射免疫分析,該方法已經(jīng)廣泛應用于食品衛(wèi)生檢測、臨床標本檢測.

劉飛[6]使用常規(guī)方法制備了20株針對SEB分子的單克隆抗體,并從中篩選出兩株效價高、特異性強,識別不同表位組的兩株單克隆抗體,組成抗體配對,通過微孔板式化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法對金黃色葡萄球菌腸毒素B進行檢測.結(jié)果顯示:此方法的檢測限達到0.01 ng/mL,具有高特異性、高靈敏度、操作簡單等優(yōu)點.

2.3 分子生物學方法

聚合酶鏈式反應是1985年由Mullis等發(fā)明,采用DNA聚合酶進行體外酶促合成、擴增特定DNA片斷的一種方法.該技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、快速準確、高效等特點,因此在醫(yī)學、生命科學、農(nóng)業(yè)科學、環(huán)境科學、考古學等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應用.

2.3.1 多重PCR技術(shù)

隨著聚合酶鏈式反應技術(shù)的發(fā)展,多重PCR法在檢測金黃色葡萄球菌中得到了應用.其基本原理是同一反應體系中,同時加入多對引物,與此同時對多個特異性目的基因片段同時進行擴增,可以達到對多種細菌進行同步檢測的目的,也可對多種類型的目的基因進行分型研究.Francois等[7]采用免疫磁珠法收集金黃色葡萄球菌,利用針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因的特異性引物和針對金黃色葡萄球菌femA基因引物,同時用兩對引物對待測菌進行PCR擴增.此方法大大提高了鑒定MRSA的準確性.當mecA和femA基因表達均為陽性時,可確定為MRSA.因此可與mecA基因陽性的其他葡萄球菌屬進行區(qū)分,此方法可同時鑒定MRSA、金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性的葡萄球菌.鄭華妮等[8]根據(jù)金黃色葡萄球菌多種腸毒素基因的通用保守序列以及特異性序列,在3～4 h內(nèi)檢測出毒素基因A-E,檢測的效果良好,建立了金黃色葡萄球菌腸毒素A-E的多重PCR檢測法.

2.3.2 實時熒光定量PCR

實時熒光PCR檢測技術(shù)(real-time fluorescent PCR)是在常規(guī)PCR中引入液相雜交技術(shù)和熒光探針,在PCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物的過程中,實時檢測收集相對應的熒光信號,從而實現(xiàn)樣品(如病原菌)的定性或定量檢測.因為只需檢測出熒光強度的即時變化就可測出樣品基因的拷貝數(shù),具有快速、高特異性和高靈敏度,目前應用比較廣泛.

蘇明權(quán)等[9]以金黃色葡萄球菌特異性femB基因序列設計引物和探針,并利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了定量檢測標準品,建立了實時熒光定量PCR檢測金黃色葡萄球菌的方法,將模擬標本與分離培養(yǎng)進行了對比,兩者符合率為100%.表明所建立的方法具有較好的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性和重復性.

2.3.3 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

2000年,日本科學家Notomi建立了一種新型的核酸擴增技術(shù),即環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP).其基本原理是針對靶基因的6個區(qū)域,設計4條特異性引物,恒溫條件,在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下幾十分鐘就可擴增出109～1010靶序列拷貝.核酸大量合成時,大量的焦磷酸根離子從dNTP中釋放,與反應體系中Mg2+形成了豐富的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀,可被肉眼觀察.與此同時,也可以通過在體系中直接添加環(huán)引物(loop)來加快反應的速率[10].LAMP技術(shù)具有高特異性、高靈敏性、簡便快速和成本低等特點.此技術(shù)已在動物疫病的診斷、動物胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應用.

2.3.4 基因芯片檢測

生物芯片技術(shù)是20世紀90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一,是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉性新技術(shù),是基礎(chǔ)研究最有效的工具.利用基因芯片技術(shù)于臨床微生物鑒定方面,將大大提高菌株的陽性檢出率,縮短檢驗時間,具有現(xiàn)實的臨床意義.1996年,世界上第一塊商業(yè)化DNA芯片的問世,標志著基因芯片技術(shù)進入廣泛研究和應用的階段,此技術(shù)具有傳統(tǒng)檢測方法無法比擬的優(yōu)越性.

2.4 金黃色葡萄球菌各種檢測技術(shù)的比較

本文對各種金黃色葡萄球菌檢測技術(shù)在優(yōu)缺點以及應用領(lǐng)域等方面進行了比較,結(jié)果如表1.

2.5 金黃色葡萄球菌檢測常用的特異性基因

本文將常用的金黃色葡萄球菌檢測特異性基因進行了總結(jié),結(jié)果如表2.

3 總結(jié)與展望

金黃色葡萄球菌致病性和侵襲力強,其耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株已成為主要致病菌.傳統(tǒng)的檢測金黃色葡萄球菌的方法費時耗力,已經(jīng)難以滿足社會的需求.金黃色葡萄球菌檢測技術(shù)將向著更快速、更簡易、更準確的方向發(fā)展.顯色培養(yǎng)基具有靈敏、特異、簡便等優(yōu)點,雖存在假陽性與假陰性菌株的干擾,但與其他方法聯(lián)用時可提高檢測準確率;快速測試片法既具備了顯色培養(yǎng)基的優(yōu)點,又方便快捷,成本低廉,可定量,雖然受載體材料對于計數(shù)的影響,但不影響對于金黃色葡萄球菌的定性,適合于基層單位的快速檢測;免疫學方法則在對于基質(zhì)復雜的樣品檢測表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性,其中酶聯(lián)免疫的商品化的試劑盒只能檢測到SEA～SEE,不能檢測新型的SE,且無法同時檢測多種類型的SE,與其他的方法相結(jié)合(如化學發(fā)光法等),可以達到提高檢測的靈敏度;熒光定量PCR比常規(guī)PCR靈敏度和特異性更高,更快速,但由于成本較高,使用上仍然受到限制,適用于要求特異性與靈敏度較高的定量檢測;多重PCR可同時檢測多種病原菌,若與Real-time PCR相結(jié)合,不失為高效檢測金黃色葡萄球菌以及其他致病菌的另一途徑;LAMP方法不僅在檢測的特異性和靈敏度上表現(xiàn)突出,其操作十分簡便,設備僅需要恒溫儀器,檢測迅速,60 min內(nèi)即可完成檢測,檢測結(jié)果肉眼可見,成本低廉.雖存在引物設計上的復雜性以及基質(zhì)復雜的樣品檢測存在一定的局限性,但LAMP法作為一種基層現(xiàn)場快速檢測金黃色葡萄球菌的方法,具有良好的應用前景.

表1 金黃色葡萄球菌各種檢測技術(shù)的比較Tab.1 Comparison of Staphylococcus aureus detection technologies

表2 金黃色葡萄球菌檢測的特異性基因Tab.2 Detection of specific genes of Staphylococcus aureus

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