宋玉民 李文娟 楊美玲

(西北師范大學化學化工學院，蘭州730070)

稀土元素是21世紀具有戰(zhàn)略地位的元素，憑借其獨特的光、電、磁等物理化學特性，廣泛應用于國民經(jīng)濟和國防工業(yè)的各個領(lǐng)域。被稱為“21世紀新材料的寶庫”[1]。在最近幾年，稀土元素由于其重要的生物活性和藥理學作用，越來越受到人們的關(guān)注[2-3]。全反式維甲酸(retinoic acid，ATRA)又稱維生素A酸，是維生素A(retinol)的衍生物，更是機體正常發(fā)育和各種生理功能所必須的物質(zhì)。維生素甲類化合物(簡稱維甲類化合物，Retinoid)在腫瘤防治上的潛力已經(jīng)引起了廣泛的注意。李海燕等報道了全反式維甲酸對人肝癌SMMC-7721細胞侵襲能力的影響[4]，探討了ATRA對人肝癌細胞株SMMC-7721遷移侵襲能力的影響，為ATRA應用于臨床的肝癌治療提供實驗依據(jù)。戴洪海等報道了9-順維甲酸(RA)誘導肺癌組織RARβ轉(zhuǎn)錄的研究[5]，探討了RA的抑瘤分子機制，為臨床應用RA治療肺癌提供了某些理論依據(jù)。胡寶光等報道了全反式維甲酸對人結(jié)腸癌LoVo細胞化療藥物敏感性及Survivin基因表達的影響[6]，探討ATRA對其化療藥物敏感性的影響，并通過檢測細胞內(nèi)Survivin的表達情況分析產(chǎn)生這些作用的可能機制，為進一步臨床應用提供理論依據(jù)。這些研究為維甲類化合物在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的應用拓寬了道路。但由于維甲酸類化合物具有一定的毒副作用，長期大量服用可引起嚴重中毒，因此限制了其在藥理上的應用。氨基酸是生物體內(nèi)大量存在的一類生物大分子，是蛋白質(zhì)、酶等的基本結(jié)構(gòu)單元，也是生命體存在的營養(yǎng)物質(zhì)，許多氨基酸的金屬配合物具有抗菌，抗炎，抗癌和拮抗作用等生物活性，其衍生物已廣泛應用于醫(yī)藥方面[7]。以鄰菲啰啉作為第一配體和以天冬氨酸，蛋氨酸，亮氨酸等作為第二配體的稀土三元配合物目前已有研究報道[8]。何其莊等[9]發(fā)表了稀土天冬氨酸鄰菲咯啉三元配合物的合成、表征及其生物活性研究，探索了該類稀土三元配合物的抗癌活性，為該類配合物在殺菌抗癌藥物、分子生物學、生物工程技術(shù)及其他相關(guān)領(lǐng)域的應用提供了一定的依據(jù)，對于設計合成出具有應用價值的低毒、抗菌、抗癌藥物有十分重要的指導意義。李小慧[10]等發(fā)表了稀土-L-亮氨酸-鄰菲啰啉的配合物合成及其抑菌活性，這為考察稀土配合物的生物活性和進一步探索新型、高效、低毒、副作用小的稀土抑菌藥物提供參考，它們對生態(tài)環(huán)境和人類健康,有著重要意義。為降低維甲酸分子在作為藥物使用時的毒副作用和增加生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)，本文報道了稀土離子 (Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)-全反式維甲酸-精氨酸三元配合物的合成表征和其抗腫瘤活性進行體外實驗的研究結(jié)果。表明配合物的抗腫瘤活性基本強于配體全反式維甲酸、L-精氨酸鹽酸鹽和相應的金屬硝酸鹽。稀土配合物對3種癌細胞株生長的抑制作用也基本上隨配合物濃度的增大而增強。為了解配合物的抗腫瘤作用的原因，采用光譜方法和粘度法對配合物與DNA之間的相互作用方式進行了考察，為研究配合物的生物活性與DNA作用方式之間的聯(lián)系提供了實驗依據(jù)[11]，也為進一步探索新型、高效、長效、安全、穩(wěn)定、副作用小的抗腫瘤藥物提供了參考。目前關(guān)于維生素甲酸抗腫瘤研究國內(nèi)已有報道,但全反式維甲酸與稀土和精氨酸配合物的合成及其抗腫瘤活性報道較少。

圖1 全反式維甲酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of all-trans retinoic acid

圖2 L-精氨酸鹽酸鹽的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of L-arginine acid hydrochloride

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TJ270230型紅外光譜儀 (DIGILAB公司)；RF-540熒光分光光度計(日本島津公司)；UV-3400紫外分光光度計(日本島津公司)；TB285型恒溫器(日本島津公司)；LDZX4OCI型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠)；DHG9070A型電熱恒溫干燥箱(上海益恒實驗儀器有限公司)；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器 (鞏義市英峪予儀器廠)；R-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 (力康heal force hf90/hf240)；酶標儀(Bio-Rad,model 550)。

全反式維甲酸C20H28O2(鄭州天健生物技術(shù)有限公司)；L-精氨酸鹽酸鹽 C6H14N4O2·HCl(生化試劑，北京醫(yī)藥站)；稀土硝酸鹽用氧化物制備；溴化乙錠(EB)購自華美生物工程公司，其它試劑均為分析純，水為二次蒸餾水，Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.34)。

1.2 配合物的合成

稱取2 mmol全反式維甲酸于圓底燒瓶中，加10 ml無水乙醇，在60℃水浴下加熱攪拌使其全部溶解，分別向該溶液中先后加入含1 mmol六水合稀土硝酸鹽水溶液和含1 mmol L-精氨酸鹽酸鹽(LArg)水溶液。滴加完畢后，用濃NH3·H2O調(diào)節(jié)pH=6.0～7.0。在 60℃恒溫下持續(xù)加熱攪拌回流 7 h，35℃水浴下旋蒸得粉末狀粗產(chǎn)物。用二次蒸餾水和無水乙醇洗滌粗產(chǎn)物3次，置于30℃烘箱中烘干，即得到稀土-全反式維甲酸-精氨酸三元配合物。

配體及其配合物用無水乙醇和Tris-HCl緩沖溶液溶解，配制成1 mmol·L-1的溶液待用。

1.3 配合物抗腫瘤活性實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，并置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細胞呈單層貼壁生長，用倒置的顯微鏡觀察細胞生長情況和貼壁形態(tài)，并取指數(shù)生長期的腫瘤細胞(HepG2、A549 和 Hela)用于實驗。

1.3.2 配合物溶液配制

用高壓滅菌過的2 mL塑料小試管稱取一定量的三元配合物，用少量DMSO溶解之后，再用PBS緩沖溶液稀釋至 10-8～10-3mol·L-1。

1.3.3 細胞活力的測試

將細胞接種于96孔培養(yǎng)板 (細胞密度1×104mL-1)中，待貼壁后分別加入不同濃度的三元配合物20 μL(含 0.1 μL 的 DMSO)和 180 μL 的培養(yǎng)基，對照組加等體積的1640培養(yǎng)基，每組6復孔，平行4復孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄去上清液后每孔加入150 μL的DMSO，振蕩5 min后用酶標儀(波長560 nm)測定其吸光度值，計算細胞的生長存活率。用只加培養(yǎng)液而不加細胞的孔調(diào)零[12]。細胞存活率按下列公式計算：

細胞存活率%=實驗組A570/對照組A570×100%，抑制率%=1-細胞存活率%。

1.4 配合物與DNA作用的研究

1.4.1 熒光光譜與紫外光譜

1.4.1.1 DNA 對 4 種配合物熒光光譜的影響

取濃度為 1×10-4mol·L-1的配合物溶液 3 mL，在激發(fā)波長為425 nm條件下掃描其熒光光譜。在該溶液中加入DNA(1 mmol·L-1)的溶液，搖勻靜置0.5 h后在上述條件下掃描配合物-DNA體系熒光發(fā)射譜圖。

1.4.1.2 配合物對EB-DNA體系熒光強度的影響

在 EB-DNA 體系溶液中(cEB/cDNA=12.5)，加入配合物溶液，0.5 h后，在上述條件下掃描其熒光發(fā)射譜圖。

1.4.1.3 EB 對配合物-DNA 體系熒光強度的影響

在配合物-DNA(c配合物/cDNA=2.5)體系中，加入不同量的 EB(1.25 mmol·L-1)，0.5 h 后，在給定的條件下掃描其熒光發(fā)射譜圖。

1.4.1.4 配合物-DNA 體系的紫外光譜

以緩沖溶液為參比，掃描配合物溶液 (4×10-4mol·L-1)、DNA 的溶液 (4×10-4mol·L-1)、 配合物與DNA的混合溶液在200～500 nm的紫外光譜。

1.4.2 粘度研究

取 DNA(1 mmol·L-1)溶液 7.5 mL，加入不同量的配合物和緩沖溶液，溶液的總體積為15mL，混合后1、48、96 h測其粘度。采用同樣的方法測EBDNA溶液粘度，以DNA溶液為參比得相對粘度。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的表征

2.1.1 配合物的組成及一般性質(zhì)

合成得到的 4 種稀土(Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)-全反式維甲酸-精氨酸的配合物分別為深黃色、橙色、深橙色、和土黃色粉末狀固體，產(chǎn)率為71%左右。較易溶于無水乙醇和DMSO，難溶于水，其溶解性不同于單獨的稀土鹽、全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽，經(jīng)洗滌和重結(jié)晶可提純。配合物的元素分析實驗結(jié)果與理論值基本吻合，結(jié)合熱重分析測試結(jié)果推測配合物的化學組成為REL2L′Cl·nH2O。元素分析結(jié)果如表1。

2.1.2 紅外光譜

以KBr壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)測定了配體及各種配合物的紅外光譜。圖3和圖4分別為配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽以及4種配合物的紅外圖譜。從圖中可以看出，配合物和配體的紅外光譜圖有較大的區(qū)別，而配合物的譜圖之間卻極為相似，說明各配合物的組成和結(jié)構(gòu)相似。配合物與配體相比，配體某些特征吸收峰在配合物中發(fā)生了明顯的位移，強度也有著相應的變化，說明全反式維甲酸、精氨酸與稀土離子發(fā)生了配位。

表1 配合物的元素分析Table 1 Elemental analysis of complexes

圖3 配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽紅外圖譜Fig.3 IR spectra of ligands

圖4 4種配合物的紅外圖譜Fig.4 IR spectra of complexes

全反式維甲酸分子的羧酸中的羰基振動峰出現(xiàn)在1 685.78 cm-1，O-H的面外變形振動吸收峰出現(xiàn)在 1 050～950 cm-1；精氨酸鹽酸鹽在 1 683.33 cm-1處有一羰基振動峰，O-H的面外變形振動吸收峰出現(xiàn)在950～900 cm-1。而配合物中的羰基峰出現(xiàn)在1 650.92 cm-1，1 656.31 cm-1，1 662.52 cm-1，1 660.54 cm-1，1 100～900 cm-1范圍無吸收，推測2種配體的羧酸失去質(zhì)子，羧基的羥基氧和羰基氧與稀土離子（Ⅲ）發(fā)生了配位作用 。在 741.51 cm-1，738.24 cm-1，739.54 cm-1，760.25 cm-1左右出現(xiàn)的 RE-O 振動吸收峰進一步說明了全反式維甲酸、精氨酸與稀土離子發(fā)生了配位。配合物分別在 3 424.81 cm-1，3 424.01 cm-1，3 424.96 cm-1，3 412.06 cm-1處的一寬峰是配合物中水分子羥基的對稱和反對稱伸縮振動，說明在配合物中存在水分子。

游離的L-精氨酸鹽酸鹽在2 930.63 cm-1出現(xiàn)了NH3+的對稱伸縮振動峰，此峰仍然出現(xiàn)在配合物的紅外吸收圖譜中，由此排除了L-精氨酸中氮原子配位的可能性[10]。圖中(L=全反式維甲酸，ATRA)；L′=L-精氨酸陽離子，L-Arg)。

2.1.3 配合物的熱分解性質(zhì)

以α-Al2O3作為參比，在升溫速率10℃·min-1的N2氣氛中，掃描配合物從室溫到700℃的熱重-差熱(TG-DTA)曲線，數(shù)據(jù)列于表2。

圖5 配合物NdL2L′Cl的熱重-差熱譜圖Fig.5 TG-DTA curve of complex(NdL2L′Cl)

表2 配合物的TG-DTA數(shù)據(jù)Table 2 TG-DTA data of complexes

圖5為NdL2L′Cl·8H2O配合物的熱重-差熱譜圖，可以看出，室溫～200℃出現(xiàn)第一個失重臺階(失重率 14.1%)，200～450 ℃出現(xiàn)第二個失重臺階(失重率 57.8%)，450～550 ℃出現(xiàn)第三個失重臺階(失重率15.9%)，分別對應著失去的 8 個水分子(結(jié)晶)，2 個維甲酸分子和1個精氨酸分子。1個吸熱峰和2個放熱峰分別出現(xiàn)在 80～120℃、200℃、500～510℃。到650℃左右時，熱重曲線趨于恒定 (總失重率為87.8%)，配合物最終分解產(chǎn)物為稀土氧化物，經(jīng)過計算與理論值基本相符。幾種配合物之間的熱譜圖相似，說明它們的結(jié)構(gòu)也相似[13]。維甲酸在150℃出現(xiàn)失重開始分解，并伴隨有吸熱峰產(chǎn)生，在250～260℃出現(xiàn)氧化放熱峰，600℃分解完全，總失重率為100%。精氨酸鹽酸鹽在240～250℃出現(xiàn)一個失重臺階，并伴隨有大的尖銳的吸熱峰出現(xiàn)，失重率16.1%，為 HCl分子的氣化，250～600 ℃出現(xiàn)第二個失重臺階，為精氨酸的骨架斷裂和氧化分解失重所致，吸熱峰出現(xiàn)在250～260℃，放熱峰出現(xiàn)在380～400℃，700℃分解完全。對照維甲酸和精氨酸鹽酸鹽中的骨架斷裂峰溫，可以發(fā)現(xiàn)，所形成配合物的骨架斷裂峰溫升高,這表明配合物的穩(wěn)定性大于游離配體。

2.1.4 配體及配合物的光譜性質(zhì)

圖6 配體及配合物的紫外-可見光譜圖Fig.6 UV-Vis absorption spectra of ATRA and complexes

圖6為配體全反式維甲酸和配合物的紫外-可見光譜圖。由圖可知，在相同濃度條件下 (1×10-4mol·L-1)，配合物的吸收峰略有紅移，但配合物溶液的吸收強度高于配體。其中Nd和La配合物的紫外吸收強度大大增加。由于全反式維甲酸中共軛雙鍵的π→π*躍遷產(chǎn)生了對光的吸收，配合物的紫外-可見吸收峰的位移和強度的變化，可能是由配體中的氧原子與稀土離子形成配位鍵后，配位原子的電子云向稀土離子的空軌道轉(zhuǎn)移，配體中共軛電子的離域化程度增加，電子躍遷的能級差有所減小，導致配合物對紫外光的吸收作用增強并產(chǎn)生了紅移。精氨酸鹽酸鹽在250～500 nm范圍無吸收。圖7為室溫條件下，以λex=425 nm為激發(fā)波長，維甲酸(1×10-5mol·L-1)與配合物(1×10-5mol·L-1)的熒光光譜圖。由圖可知，維甲酸在λem=450 nm附近有熒光發(fā)射峰，配合物在λem=470 nm附近有熒光發(fā)射峰，熒光峰位置的變化，說明稀土離子和配體發(fā)生了配位作用。而配合物的熒光發(fā)射峰強度均比配體的熒光發(fā)射峰強度低。熒光強度的變化，說明稀土金屬離子和配體發(fā)生了配位作用。

圖7 配體及配合物的熒光光譜圖Fig.7 Emission spectra of ATRA and complexes

2.2 抗腫瘤實驗

采用MTT法測試了稀土硝酸鹽、配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽以及三元配合物的抗腫瘤活性，陽性對照藥為順鉑，測試的細胞株種類為體外培養(yǎng)的人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549和人宮頸癌細胞Hela。表3為稀土鹽類、配體和配合物對不同腫瘤細胞瘤株的IC50值。

表3 稀土鹽、配體和配合物對不同腫瘤細胞瘤株的IC50值Table 3 IC50 values of compounds on different tumor cells

2.2.1 配體和配合物對人肝癌細胞HepG2的抑制作用

圖8為配體和4種配合物在濃度為10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用。由表3和圖8可以看出：(1)金屬 (Nd、La和Sc)配合物對人肝癌細胞HepG2半數(shù)抑制濃度均為10-3mol·L-1，且Sc和 Nd配合物的抑制率高達90%以上，而Eu配合物對人肝癌細胞HepG2半數(shù)抑制濃度為10-4mol·L-1，這意味著Eu配合物在較低濃度時對HepG2有明顯的抑制作用；(2)當c≥10-4mol·L-1時，4種配合物對HepG2的抑制率都大于金屬硝酸鹽(20.04%～33.47%)和它們的兩種配體，在濃度為10-8～10-3mol·L-1范圍內(nèi)，配合物對 HepG2的抑制率始終大于配體精氨酸；(3)La配合物對腫瘤細胞的抑制率在測試的濃度范圍內(nèi)始終低于其它配合物；(4)從總體趨勢來看，隨著配合物濃度的逐漸增加，配合物的抗腫瘤活性也隨之而增加。

圖8 配合物與配體對HepG2細胞的抑制率Fig.8 HepG2 inhibition rate of complexes and ligands

2.2.2 配體和配合物對人肺癌細胞A549的抑制作用

圖9為配體和4種配合物在濃度為10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)對人肺癌細胞A549增殖的抑制作用。由表3和圖9可以看出：(1)金屬配合物NdL2LCl、EuL2L′Cl和 LaL2L′Cl對人肺癌細胞 A549的抑制作用在10-8～10-3mol·L-1都隨濃度的增大而增強，而 ScL2L′Cl在 10-8～10-6mol·L-1時抑制率隨著濃度的增加而增大，10-6～10-5mol·L-1時抑制率隨著濃度的增加而減小，隨后又繼續(xù)增大，且增幅較大；(2)當濃度為 10-5～10-3mol·L-1時，配合物對A549的抑制作用明顯大于金屬硝酸鹽 (4.79%～28.37%)和兩種配體；(3)10-4mol·L-1為 LaL2L′Cl和ScL2L′Cl的半數(shù)抑制濃度，10-3mol·L-1為 NdL2L′Cl、EuL2L′Cl的半數(shù)抑制濃度，說明此種癌細胞的增殖對 LaL2L′Cl和 ScL2L′Cl配合物較為敏感；(4)金屬配合物在濃度為10-3mol·L-1時抑制率最高，ScL2L′Cl的抑制率高達87.64%。

圖9 配合物與配體對A549細胞的抑制率Fig.9 A549 inhibition rate of complexes and ligands

2.2.3 配體和配合物對人宮頸癌細胞Hela的抑制作用

圖10 配合物與配體對Hela細胞的抑制率Fig.10 Hela inhibition rate of complexes and ligands

圖10為配體和4種配合物在濃度為10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)對人宮頸癌細胞Hela增殖的抑制作用。由表3和圖10可以看出：(1)配合物在相對較小的濃度(10-6mol·L-1)時已經(jīng)超過了對細胞半數(shù)抑制濃度，配合物對此種癌細胞的抑制作用強于其它 2種癌細胞；(2)在測試濃度為 10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)，配合物對Hela增殖的抑制作用始終大于 2 種配體及其稀土硝酸鹽 (11.02%～34.17%)；(3)幾種配合物對Hela增殖的抑制作用隨著濃度的增加而逐漸增大，當濃度增大到10-3mol·L-1時，每種配合物對Hela增殖的抑制作用也達到最大值，EuL2L′Cl的抑制率高達 80.36%，ScL2L′Cl的抑制率高達 83.20%；(4)在濃度為 10-8～10-5mol·L-1的范圍內(nèi)，LaL2L′Cl對Hela增殖的抑制作用始終大于其它配合物。

由以上實驗結(jié)果可以看出，配合物對所測試的3種腫瘤細胞株的抑制率一般強于金屬硝酸鹽、配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽。這是因為帶有芳環(huán)基團的金屬配合物可通過嵌插作用插入到細胞的DNA分子內(nèi)堿基對之間，通過破壞堿基堆積力，從而影響DNA分子的內(nèi)部構(gòu)型，來抑制DNA分子的進一步復制和遺傳；稀土離子與配體螯合生成配合物以后，正電荷部分轉(zhuǎn)移到配體上，使螯合環(huán)上的電子產(chǎn)生離域效應，導致稀土離子極性降低，這樣就增強了配合物的脂溶性，以致配合物能更好地穿透微生物細胞膜的類脂層，這種增強的穿透作用破壞了細胞膜的通透性，也可導致細胞凋亡；另外配合物中存在金屬離子，能使蛋白質(zhì)立體構(gòu)象發(fā)生變化以致蛋白質(zhì)變性，使得配合物對腫瘤細胞的生長抑制作用強于配體，發(fā)揮了配體與金屬的協(xié)同作用[14-15]。一般認為配體和配合物的相對生物活性大小隨濃度變化的原因與配體和配合物分子的性質(zhì)、穩(wěn)定性及在某些濃度范圍內(nèi)的存在形式(聚合、解離)有關(guān)。本論文中合成的配合物依金屬原子的不同呈現(xiàn)不同的抗腫瘤活性，可能與稀土離子各自的半徑、所帶的有效核電荷有關(guān)。在濃度為10-3mol·L-1時，ScL2L′Cl配合物對 3 種腫瘤細胞的抑制最強，抑制率在80%以上，其它3種配合物的抑制率超過60%，說明ScL2L′Cl配合物有較大的潛在藥物使用價值。

2.3 配合物與DNA的相互作用

為了解配合物抗腫瘤作用的機理，對配合物和生物大分子DNA之間的相互作用方式進行了研究考察。

2.3.1 配合物與DNA作用的熒光光譜

2.3.1.1 DNA 對配合物熒光強度的影響

配合物NdL2L′Cl的熒光光譜圖如圖11所示。由圖11可以看出，在DNA的存在下，配合物的熒光發(fā)射峰位沒有發(fā)生變化，熒光強度有較大增加，產(chǎn)生了明顯的增色效應。增色效應是由于DNA堿基與嵌入其間的小分子產(chǎn)生電子相互作用引起的[16-17]。DNA的加入引起配合物熒光強度增加的現(xiàn)象，和已知的一些嵌入試劑在DNA存在時熒光強度增加的現(xiàn)象是一致的[18-19]，由此可初步推測，配合物可能嵌入到DNA堿基對中。

圖11 DNA對配合物熒光強度的影響Fig.11 Emission spectra(excited at 425 nm,5 mL NdL2L′Cl solution)

2.3.1.2 配合物對EB-DNA體系熒光強度的影響

溴化乙錠(EB)本身的熒光很弱，但嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后熒光強度顯著增強。如果在EB-DNA體系中加入的有機小分子M也能與DNA發(fā)生類似于EB的嵌入作用，這個小分子就會與EB競爭同DNA的結(jié)合位點，使EB-DNA體系的熒光強度減弱。一般認為當EB-DNA體系的熒光強度減弱50%，且cM/cDNA＜100時，M與DNA發(fā)生了類似于EB的嵌入作用[20-21]。NdL2L′Cl配合物對EB-DNA體系熒光強度影響的結(jié)果如圖10所示，在不同量的配合物存在下，EB-DNA體系的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生移動，其熒光強度隨(cNd/cDNA)的比值R的增大而減小(EB-DNA體系的熒光強度減弱至50%時，cNd/cDNA=12.5)，結(jié)果見圖12。這就說明配合物發(fā)生了類似于EB的嵌入作用。

圖12 NdL2L′Cl對EB-DNA體系熒光強度的影響Fig.12 Emission spectra(excited at 425 nm,5 mLsolution)

2.3.1.3 EB 對 NdL2L′Cl-DNA 體系熒光強度的影響

為了進一步考察配合物與DNA的作用方式，在 NdL2L′Cl-DNA(c配合物/cDNA=2.5)體系中加入了 EB，結(jié)果如圖13所示。當加入EB時，發(fā)現(xiàn)配合物-DNA體系的熒光強度隨EB的增加而下降。而在600 nm處出現(xiàn)了EB-DNA體系的熒光發(fā)射峰，峰強度隨著EB濃度的增加而迅速增大。加入EB使得NdL2L′Cl-DNA體系熒光強度降低，說明EB分子可能取代了NdL2L′Cl-DNA體系中部分配合物分子，形成EBDNA復合物體系，導致了NdL2L′Cl-DNA體系熒光強度的降低和標志EB-DNA新體系形成的新峰的出現(xiàn)。EB能使配合物-DNA體系在470 nm處的熒光產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象，而且猝滅程度隨EB濃度的增加而加大，由此推斷，配合物與DNA的作用方式與EB與DNA作用方式應該是相似的，均為嵌入方式[22]。

圖13 EB對NdL2L′Cl-DNA體系熒光強度的影響Fig.13 Emission spectra(excited at 425 nm,5 mL solution)

2.3.2 配合物與DNA作用的紫外光譜

DNA 溶液 (4×10-4mol·L-1)、NdL2L′Cl(4×10-4mol·L-1) 溶液、DNA-NdL2L′Cl體系的紫外光譜如圖14所示。NdL2L′Cl在350 nm處有吸收峰，DNA在260～280 nm處有吸收峰，當在DNA溶液中加入NdL2L′Cl配合物時，DNA 在 260～280 nm 處的吸收峰的強度明顯降低，而且出現(xiàn)了一定的紅移現(xiàn)象。減色效應和紅移現(xiàn)象說明配合物確實與DNA發(fā)生了相互作用而引起了配合物或DNA紫外光譜的變化。因為在紫外吸收光譜中所反映的減色效應是由于DNA的堿基與嵌入其間的有機小分子產(chǎn)生的相互作用而引起的[16,23]，而有機小分子與DNA相互作用程度的大小與小分子距DNA堿基對之間的距離的三次方成反比[23]，較大的減色效應意味著配合物與DNA堿基對之間的距離小，所以小分子就容易嵌入到DNA堿基對中[24]。因此在配合物或DNA的紫外吸收圖譜上的減色效應以及紅移或紫移現(xiàn)象說明了配合物與DNA之間的作用可能是嵌入式的，可初步推斷NdL2L′Cl嵌入到DNA堿基對中。破壞了芳環(huán)的堆積作用，使得DNA分子的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響了細胞中DNA分子的復制，使得配合物對腫瘤細胞有一定的抑制作用。

圖14 DNA-NdL2L′Cl體系紫外光譜圖Fig.14 UV spectra of(a)DNA,(b)DNA-NdL2L′Cl,(c)NdL2L′Cl

2.3.3 EB和配合物對DNA粘度的影響

為進一步確定配合物與DNA的作用方式，用烏貝路德粘度計在20℃測定了DNA在EB、NdL2L′Cl配合物存在時的粘度變化，結(jié)果列于表4。

表4 DNA相對粘度(ηr)的變化Table 4 Variation of the relative viscosity of DNA

由表4可以看出，DNA的相對粘度隨著EB和配合物NdL2L′Cl濃度的增加而增大，說明配合物NdL2L′Cl與DNA的作用方式確實類似于EB與DNA的作用方式，為嵌入式[25]。這和NdL2L′Cl配合物與EB競爭結(jié)合DNA的熒光法試驗結(jié)果是一致的。

3 結(jié) 論

本文用稀土離子(Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)的硝酸鹽、具有一定抗腫瘤作用的全反式維甲酸和營養(yǎng)物質(zhì)L-精氨酸鹽酸鹽合成了4種稀土配合物，推測其化學組成為 RE(ATRA)2(L-Arg)Cl·nH2O，其結(jié)構(gòu)可能為：

抗腫瘤實驗表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，配合物的抗腫瘤活性優(yōu)于金屬硝酸鹽、配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽，當配合物濃度為1 mmol·L-1時，ScL2L′Cl配合物對3種腫瘤細胞的抑制最強，抑制率在80%以上，其它3種配合物的抑制率超過60%，說明ScL2L′Cl配合物有較大的潛在藥物使用價值。

通過研究配合物與DNA的相互作用方式，初步說明配合物分子嵌入DNA堿基對之間，是配合物具有抗腫瘤活性的原因之一。

[1]XIAO Fang-Ming(肖方明).Technology Roadmap of the Rare-earth Industry in Guangdong Province(廣東省稀土產(chǎn)業(yè)技術(shù)路線圖).Guangzhou:South China University of Technology Press,2011.

[2]Sert S,Kutahyali C,Inan S,et al.Hydrometallurgy,2008,90(1):13-18

[3]Garner J P,Heppell P S.Burns,2005,31(5):539-547

[4]LI Hai-Yan(李海燕),CAO Li-Min(曹勵民),WANG Bing-Liang(王秉亮).J.China Med.Univ.(中國醫(yī)科大學學報),2013,42(2):106-110

[5]DAI Hong-Hai(戴洪海),CHEN Ping(陳萍),HU Guo-Qiang(胡國強),et al.Chin.J.Cancer Prevention(中華腫瘤防治雜志),2006,13(21):1605-1608

[6]HU Bao-Guang(胡寶光),ZHENG Zong-Heng(鄭宗珩),WEI Hong-Bo(衛(wèi)洪波),et al.Chin.J.Biomed.Eng.(中華生物醫(yī)學工程),2011,17(1):19-24

[7]JIA Wei-Tao(賈韋韜),LU Hao-Jie(陸豪杰),YUN Dong(贠棟),et al.Acta Chim.Sin.(化學學報),2007,65(3):177-183

[8]SHANG Yan-Fang(商艷芳),GE Cun-Wang(葛存旺),WU Chang-Yue(吳昌月),et al.Chem.Reagent(化學試劑),2009,31(12):971-973,980

[9]HE Qi-Zhuang(何其莊),YU Hui(郁慧),ZHOU Mei-Feng(周美峰),et al.J.Chinese Soc.Rare Earths(中國稀土學報),2007,25(2):150-156

[10]LI Xiao-Hui(李小慧),WANG Wei-Dong(王衛(wèi)東),HU Yuan-Liang(胡遠亮),et al.J.Chinese Soc.Rare Earths(中國稀土學報),2012,30(1):1-6

[11]SONG Yu-Min(宋玉民),YANG Pei-Ju(楊培菊),WANG Liu-Fang(王流芳),et al.Acta Chim.Sin.(化學學報),2003,61(8):1266-1270

[12]LIU Jie(劉潔),WEI Chun-Ying(魏春英),YANG Pin(楊頻).Acta Chim.Sin.(化學學報),2012,70(3):277-283

[13]XU Jun-Peng(許軍鵬),LIU Jing-Wang(劉景旺),DA Wen-Yan(達文燕),et al.J.Chinese Soc.Rare Earths(中國稀土學報),2009,27(1):68-75

[14]ZHANG Qi-Xiong(張齊雄),SHI Lun-Yong(施倫勇),LIU Yan-Ji(劉衍季).Nat.Prod.Res.Dev.(天然產(chǎn)物研究開發(fā)),2012,24(10):1398-1401

[15]HE Dong-Shan(何東山),MAI Yu-Liang(麥裕良),YU Lin(余林).Fine Chem.(精細化工),2013,30(1):12-16

[16]Long E C,Barton J K.Acc.Chem.Res.,1990,23(9):271-273

[17]CHENG Guo-Zhen(陳國珍),HUANG Xian-Zhi(黃賢智),XU Jin-Gou(許金鉤),et al.Fluorescence Analysis.2nd Ed.(熒光分析.2版).Beijing:Science Press,1990:201-212

[18]YANG Pin(楊頻),GAO Fei(高飛).Principles of Bioinorganic Chemistry(生物無機化學原理).Beijing:Science Press,2002:329-331

[19]LU Ji-Xin(盧繼新),ZHANG Gui-Zhu(張貴珠),HUANG Zhi-Na(黃志娜),et al.Acta.Chim.Sin.(化學學報),2002,60(6):967-972

[20]LI Lai-Sheng(李來生),HUANG Wei-Dong(黃偉東),WANG Li-Ping(王麗蘋),et al.Acta Chim.Sin.(化學學報),2002,60(1):98-104

[21]LI Wen-You(李文友),ZHU Shou-Tian(朱守田),HE Xi-Wen(何錫文),et al.Acta Chim.Sin.(化學學報),2002,60(1):105-108

[22]ZHANG Rong-Ying(張蓉穎),PANG Dai-Wen(龐代文),CAI Ru-Xiu(蔡汝秀).Chem.J.Chinese Universities(高等學校化學學報),1999,20(8):1201-1207

[23]Cantor C,Schimmel P R.Biophysical Chemistry:Vol.2.San Francisco:Freeman W H,1980:398

[24]Kumar C V,Asuncion E H.J.Am.Chem.Soc.,1993,115(19):8547-8553

[25]HUANG Jun-Teng(黃 俊 騰),ZHANG Yang(張 陽),WANG Xiang-Li(王湘利),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(無機化學學報),2013,29(8):1649-1656