王玉紅等

摘 要：TCP家族是一類與植物器官三維形態(tài)發(fā)育或細胞周期調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過SeqHunter2軟件，在玉米基因組范圍內(nèi)進行TCP家族基因的搜索和鑒定。共鑒定了7個玉米TCP家族基因，并根據(jù)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)將其分為兩大類：ClassⅠ和ClassⅡ。通過玉米、擬南芥和水稻TCP家族的進化分析推測，玉米發(fā)生了特有的TCP家族基因擴增事件，這些物種分化后進化出的基因可能參與了玉米特有的生命活動或與玉米特有的生物特征相關(guān)。玉米7個TCP轉(zhuǎn)錄因子的保守基序在組成上存在差異，但均含有TCP家族中最保守的兩個基序。

關(guān)鍵詞：生物信息學(xué)；TCP；玉米

中圖分類號：Q78 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0001-06

Bioinformatics Identification and Analysis of TCP Gene Family in Maize

Wang Yuhong1， Xu Lihua2*， Li Jun1*

（1.Bio-Tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory

of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China；

2.Institute of Maize， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China）

Abstract TCP family is a kind of transcription factors which contains some genes regulating the three-dimensional morphological development of plant organs and some genes regulating the cell cycle. The SeqHunter2 soft ware was used to search and identify TCP gene family in maize genome. Seven maize （Zea may） TCP family genes were identified and classed into 2 groups， ClassⅠand ClassⅡ， based on the evolutionary tree topology. Through the evolution analysis on TCP family in maize， Arabidopsis thaliana and rice， it was predicted that the species-specific expansion of TCP family maybe occured. The expansion maybe associated with maize-specific vital movement and biological characteristics. The 7 genes had differences in motif combination， but all of them contained the 2 most conserved motifs.

Key words Bioinformatics； TCP； Maize

TCP家族基因是指含有保守的TCP結(jié)構(gòu)域的基因。TCP結(jié)構(gòu)域的名稱來源于TCP家族中最早被發(fā)現(xiàn)的3個基因：Teosinte Branched 1（Tb1），Cycloidea （Cyc）和PCFs的首字母[1]。在植物器官的發(fā)育過程中，正常的形態(tài)發(fā)育十分重要，大部分TCP家族基因與植物器官的三維形態(tài)發(fā)育調(diào)控相關(guān)，最常見的是調(diào)控植物的花器官發(fā)育與形態(tài)建成[2]。金魚草（Antirrhinum majus）花背腹不對稱極性的建立就是由TCP家族基因中的Cyc基因和Dichotoma（Dich）基因共同調(diào)控的。金魚草cyc和dich突變體的花會由兩側(cè)對稱變?yōu)檩椛鋵ΨQ[3]。柳川魚（Linaria vulgaris）的cyc突變體與金魚草cyc突變體類似，發(fā)育出了非正常對稱花[4]。另一類TCP家族基因，如水稻的PCF1和PCF2及擬南芥（Arabidopsis thaliana）的TCP轉(zhuǎn)錄因子家族則與細胞周期調(diào)控相關(guān)[4，5]。TCP核心結(jié)構(gòu)域大約包含59個氨基酸，可形成一個非典型的Basic-Helix-Loop-Helix（BHLH）結(jié)構(gòu)，部分TCP蛋白還含有一個親水的R結(jié)構(gòu)域。TCP基因家族分為2個亞類：一類與Tb1基因較為同源，一類與PCF基因同源性更高[1]。目前，在擬南芥、水稻、金魚草、柳川魚、苦苣苔科（Gesneriaceae）等多種植物中均發(fā)現(xiàn)了TCP家族基因[3，6～8]。

隨著一些植物全基因組測序的完成，利用生物信息學(xué)手段在全基因組范圍內(nèi)鑒定TCP家族基因已經(jīng)成為可能。例如，大豆、水稻和擬南芥TCP基因家族已經(jīng)在全基因組范圍內(nèi)被鑒定和分析[6，9]。在玉米中，已通過生物信息學(xué)方法鑒定出很多器官形態(tài)發(fā)育相關(guān)的基因，如SMO2基因[10]，但只鑒定出2個TCP家族基因：Teosinte Branched 1（Tb1）和BRANCH ANGLE DEFECTIVE 1（BAD1）。玉米Tb1基因可以抑制側(cè)枝生長和雄花形成，其突變會導(dǎo)致玉米頂端優(yōu)勢喪失，側(cè)枝和雄花的生長不受抑制[11]。BAD1基因可以影響玉米雄花穗分枝生長的角度，bad1突變體的雄花穗分枝聚合在一起，相比野生型玉米雄花穗分枝角度大大縮小[12]。因此，TCP家族基因?qū)τ衩椎纳L發(fā)育起到了重要作用。玉米是一種重要的糧食與經(jīng)濟作物，其基因組測序的完成，使全面鑒定和分析玉米各種基因家族成為可能，為重要基因的克隆和功能研究創(chuàng)造了條件。本研究以生物信息學(xué)手段從全基因組范圍鑒定玉米TCP家族基因，分析玉米TCP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)，對研究其在玉米發(fā)育中的功能具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以玉米為研究對象，玉米全基因組核酸序列數(shù)據(jù)、蛋白序列數(shù)據(jù)均下載自MaizeGBD（http：//www.maizegdb.org/），擬南芥和水稻TCP蛋白序列下載自GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米TCP家族基因的鑒定 從Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.sanger.ac.uk/）下載TCP結(jié)構(gòu)域的HMM序列，然后通過SeqHunter2軟件對玉米全基因組蛋白序列進行本地blast，搜索和比對玉米中的TCP家族基因。再利用Pfam以及SMART在線軟件鑒定搜索到的候選基因是否具有TCP結(jié)構(gòu)域，利用GeneDoc軟件分析這些蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)。

1.2.2 玉米、擬南芥和水稻TCP轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 將水稻、擬南芥以及預(yù)測出的玉米TCP蛋白序列利用Clustal X軟件進行多序列比對分析，序列比對結(jié)果使用MEGA 5.0程序[13]生成系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)進化樹生成算法采用鄰接法。

1.2.3 玉米TCP家族保守結(jié)構(gòu)域分析 利用在線軟件MEME 4.8.1（http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi）對玉米TCP蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析。參數(shù)設(shè)定保守基序（motif）大小為6～200 aa，輸出結(jié)構(gòu)域數(shù)目最大為20。

1.2.4 玉米TCP家族基因的染色體定位 在MaizeGBD數(shù)據(jù)庫上查詢各個預(yù)測出的玉米TCP家族基因所在位置，利用MapInspect軟件繪制出玉米TCP家族基因在各染色體上的位置分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米TCP家族基因的鑒定

通過已知的擬南芥、水稻以及玉米TCP蛋白序列獲得保守的TCP結(jié)構(gòu)域HMM序列，經(jīng)過本地blast在玉米全基因組鑒定出19個候選TCP家族基因（表1）。利用Pfam在線軟件從19個候選基因中篩選出7個基因的編碼蛋白具有完整的

TCP結(jié)構(gòu)域。通過Genedoc軟件對其蛋白序列進行比對發(fā)現(xiàn)，都具有完整的BHLH結(jié)構(gòu)域（圖1）。

因此，我們確定這7個基因為玉米TCP家族基因，其Gene ID分別為GRMZM2G110242、GRMZM2G148022、GRMZM2G089361、GRMZM2G064628、GRMZM2G055024、AC233950.1和GRMZM2G120151。其中AC233950.1和GRMZM2G110242分別為玉米Tb1基因和BAD1基因。這7個TCP家族基因分布在1、2、4、5、6、7、8號染色體上（圖2），且沒有重復(fù)序列。

2.2 玉米TCP基因家族的分類

利用水稻、擬南芥及預(yù)測的玉米TCP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），TCP家族被明顯地分為兩個進化分支，據(jù)此，將玉米TCP家族基因分為ClassⅠ和ClassⅡ兩個大類，這與以往其他物種TCP家族基因的分類一致。ClassⅠ的成員與PCF基因同源性高，而ClassⅡ的成員與Tb1基因同源性更高。這與之前的研究中將TCP家族分為PCF與Tb1兩大家族的結(jié)果一致[1]。其中GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361屬于ClassⅠ；GRMZM2G110242、GRMZM2G064628、GRMZM2G055024、AC233950.1屬于ClassⅡ。

2.3 玉米TCP家族基因結(jié)構(gòu)分析

對7個玉米TCP家族基因結(jié)構(gòu)進行分析，其中AC233950.1、GRMZM2G064628、GRMZM2G089361、GRMZM2G110242沒有內(nèi)含子；GRMZM2G120151只有一個內(nèi)含子；GRMZM2G055024有2個內(nèi)含子；GRMZM2G148022有14個內(nèi)含子（圖4）。其中，AC233950.1、GRMZM2G064628、GRMZM2G110242同時屬于ClassⅡ家族，他們與ClassⅠ家族成員GRMZM2G089361和GRMZM2G120151結(jié)構(gòu)相似，都沒有或只有1個內(nèi)含子，因此從基因結(jié)構(gòu)上推測，AC233950.1、GRMZM2G064628、GRMZM2G110242與GRMZM2G089361和GRMZM2G120151可能存在進化關(guān)系。

2.4 玉米TCP家族基因蛋白結(jié)構(gòu)分析

對7個TCP家族基因的蛋白結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，GRMZM2G148022的氨基酸序列最長，為778 aa，GRMZM2G110242（BAD1）的氨基酸序列最短，僅為276 aa。這7個蛋白序列的BHLH結(jié)構(gòu)均十分保守，由約59個氨基酸組成。利用MEME4.9.0在線軟件對擬南芥、水稻以及玉米TCP家族基因蛋白進行保守基序（motif）分析，預(yù)測出20個保守基序（圖5）。

由圖6可知，雖然7個玉米TCP家族轉(zhuǎn)錄因子的保守基序在組成上存在差異，但都共同含有各物種TCP家族中最保守的motif 1和motif 2（這兩個保守基序在水稻和擬南芥TCP家族基因里普遍存在，是TCP家族中最保守的基序），且排列順序一致，都是motif 2在前，motif 1在后，不出現(xiàn)重復(fù)。其中，motif 1位于BHLH結(jié)構(gòu)中的Basic區(qū)域中。此外，GRMZM2G148022與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242都有一個特異的保守基序motif 6，但其位置卻與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242不同。蛋白序列相似性分析顯示，GRMZM2G110242與GRMZM2G064628相似度為78%，與GRMZM2G148022相似度僅為46%。

3 討論

本研究預(yù)測了7個玉米TCP家族基因，他們都具有保守的TCP結(jié)構(gòu)域，即一種非典型的BHLH蛋白結(jié)構(gòu)。通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，這7個玉米TCP基因分屬于兩個大類：ClassⅠ和ClassⅡ。其中GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361與水稻PCF基因同源性較高，屬于PCF類TCP家族基因。水稻PCF基因可以促進分生組織中PCNA啟動子的組織特異表達，與細胞分裂周期調(diào)控密切相關(guān)[14]，因此推測GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361可能參與調(diào)控玉米分生組織細胞分裂周期，從而影響不同的原基形成，進而影響玉米器官的發(fā)育。

GRMZM2G110242（BAD1）、GRMZM2G064628、GRMZM2G055024、AC233950.1（Tb1）屬于Tb1類TCP家族基因。玉米Tb1和BAD1基因都與植物器官的三維形態(tài)發(fā)育及極性調(diào)控相關(guān)。因此GRMZM2G064628、GRMZM2G055024也可能影響玉米器官的三維形態(tài)發(fā)育及極性的建立。

玉米、水稻和擬南芥這3個物種的共計40多個TCP家族基因分散在進化樹的各個大小分支，說明TCP家族基因擴增事件在物種分化尤其是單雙子葉植物分化之前就已發(fā)生。而GRMZM2G064628和GRMZM2G110242在第二大類里單獨聚為一個小分支，說明物種形成之后玉米在ClassⅡ TCP家族基因中發(fā)生了明顯的基因擴增事件，這兩個基因可能與玉米特有的生物性狀相關(guān)。由于ClassⅡ家族基因的大部分成員同一物種發(fā)生聚類，因此推測ClassⅡ家族在進化后期逐漸形成，可能屬于年輕的一類，而ClassⅠ屬于古老的一類，ClassⅡ可能由ClassⅠ的成員進化而來。

蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，7個玉米TCP家族轉(zhuǎn)錄因子均含有TCP家族中最保守的兩個基序：motif 1和motif 2。GRMZM2G148022與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242一樣都有motif 6這個特異的保守基序，但其排列順序卻與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242不同，進化上GRMZM2G148022與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242也存在差異，屬于兩個大的分支，因此推測功能上也存在差異。

本研究為玉米TCP基因家族的功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為其進化研究提供了理論依據(jù)。

參 考 文 獻：

[1] Cubas P， Lauter N， Doebley J， et al. The TCP domain： a motif found in proteins regulating plant growth and development [J]. Plant Journal， 1999a， 18（2）： 215-222.

[2] Bowman J L， Eshed Y， Baum S F. Establishment of polarity in angiosperm lateral organs [J]. Trends in Genetics，2002， 18 （3）： 134-141.

[3] Luo D， Carpenter R， Copsey L， et al. Control of organ asymmetry in flower of Antirrhinum [J]. Cell， 1999， 99（4）： 367-367.

[4] Cubas P， Vincent C， Coen E. An epigenetic mutation responsible for natural variation in floral sysmmetry [J]. Nature， 1999b， 401（6749）：157-161.

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[7] Mller M， Clokie M， Cubas P，et al. Intergrating molecular phylogenies and developmental genetics： a Gesneriaceae case study [M]//Hollingsworth P M， Baterman R M and Gornall R J.Molecular systematics and plant evolution.London： Taylor & Francis， 1999：375-402.

[8] Citerne H L， Moller M， Crock Q C B. Diversity of cycloidea-like genes in Gesneriaceae in relation to floral sysmmetry [J]. Annals of Botany， 2000， 86（1）：167-176.

[9] 劉洋，張慧，辛大偉，等. 大豆TCP轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)構(gòu)域分析及功能預(yù)測[J].大豆科學(xué)， 2012， 31（5）： 707-713.

[10]方志軍，魯守平，董瑞，等. 玉米器官大小相關(guān)基因SMO2的鑒定和特征分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 45（3）： 4-6.

[11]Deobely J， Stec A O， Hubbard L. The evolution of apical dominance in maize [J]. Nature， 1997， 386（6624）： 485-488.

[12]Bai F， Reinheimer R， Durantini D， et al. TCP transcription factor， BRANCH ANGLE DEFECTIVE 1 （BAD1）， is required for normal tassel branch angle formation in maize [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2012， 109（30）： 12225-12230.

[13]Larkin M A， Blackshields G， Brown N P， et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 2007， 23 （21）： 2947-2948.

[14]Chatthai M， Forward B S， Yevtushenko D， et al. 2S storage protein gene of Douglas-fir： characterization and activity of promoter in transgenic tobacco seeds [J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2004， 42（5）： 417-423.

3 討論

本研究預(yù)測了7個玉米TCP家族基因，他們都具有保守的TCP結(jié)構(gòu)域，即一種非典型的BHLH蛋白結(jié)構(gòu)。通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，這7個玉米TCP基因分屬于兩個大類：ClassⅠ和ClassⅡ。其中GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361與水稻PCF基因同源性較高，屬于PCF類TCP家族基因。水稻PCF基因可以促進分生組織中PCNA啟動子的組織特異表達，與細胞分裂周期調(diào)控密切相關(guān)[14]，因此推測GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361可能參與調(diào)控玉米分生組織細胞分裂周期，從而影響不同的原基形成，進而影響玉米器官的發(fā)育。

GRMZM2G110242（BAD1）、GRMZM2G064628、GRMZM2G055024、AC233950.1（Tb1）屬于Tb1類TCP家族基因。玉米Tb1和BAD1基因都與植物器官的三維形態(tài)發(fā)育及極性調(diào)控相關(guān)。因此GRMZM2G064628、GRMZM2G055024也可能影響玉米器官的三維形態(tài)發(fā)育及極性的建立。

玉米、水稻和擬南芥這3個物種的共計40多個TCP家族基因分散在進化樹的各個大小分支，說明TCP家族基因擴增事件在物種分化尤其是單雙子葉植物分化之前就已發(fā)生。而GRMZM2G064628和GRMZM2G110242在第二大類里單獨聚為一個小分支，說明物種形成之后玉米在ClassⅡ TCP家族基因中發(fā)生了明顯的基因擴增事件，這兩個基因可能與玉米特有的生物性狀相關(guān)。由于ClassⅡ家族基因的大部分成員同一物種發(fā)生聚類，因此推測ClassⅡ家族在進化后期逐漸形成，可能屬于年輕的一類，而ClassⅠ屬于古老的一類，ClassⅡ可能由ClassⅠ的成員進化而來。

蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，7個玉米TCP家族轉(zhuǎn)錄因子均含有TCP家族中最保守的兩個基序：motif 1和motif 2。GRMZM2G148022與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242一樣都有motif 6這個特異的保守基序，但其排列順序卻與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242不同，進化上GRMZM2G148022與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242也存在差異，屬于兩個大的分支，因此推測功能上也存在差異。

本研究為玉米TCP基因家族的功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為其進化研究提供了理論依據(jù)。

參 考 文 獻：

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[8] Citerne H L， Moller M， Crock Q C B. Diversity of cycloidea-like genes in Gesneriaceae in relation to floral sysmmetry [J]. Annals of Botany， 2000， 86（1）：167-176.

[9] 劉洋，張慧，辛大偉，等. 大豆TCP轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)構(gòu)域分析及功能預(yù)測[J].大豆科學(xué)， 2012， 31（5）： 707-713.

[10]方志軍，魯守平，董瑞，等. 玉米器官大小相關(guān)基因SMO2的鑒定和特征分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 45（3）： 4-6.

[11]Deobely J， Stec A O， Hubbard L. The evolution of apical dominance in maize [J]. Nature， 1997， 386（6624）： 485-488.

[12]Bai F， Reinheimer R， Durantini D， et al. TCP transcription factor， BRANCH ANGLE DEFECTIVE 1 （BAD1）， is required for normal tassel branch angle formation in maize [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2012， 109（30）： 12225-12230.

[13]Larkin M A， Blackshields G， Brown N P， et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 2007， 23 （21）： 2947-2948.

[14]Chatthai M， Forward B S， Yevtushenko D， et al. 2S storage protein gene of Douglas-fir： characterization and activity of promoter in transgenic tobacco seeds [J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2004， 42（5）： 417-423.

3 討論

本研究預(yù)測了7個玉米TCP家族基因，他們都具有保守的TCP結(jié)構(gòu)域，即一種非典型的BHLH蛋白結(jié)構(gòu)。通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，這7個玉米TCP基因分屬于兩個大類：ClassⅠ和ClassⅡ。其中GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361與水稻PCF基因同源性較高，屬于PCF類TCP家族基因。水稻PCF基因可以促進分生組織中PCNA啟動子的組織特異表達，與細胞分裂周期調(diào)控密切相關(guān)[14]，因此推測GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361可能參與調(diào)控玉米分生組織細胞分裂周期，從而影響不同的原基形成，進而影響玉米器官的發(fā)育。

GRMZM2G110242（BAD1）、GRMZM2G064628、GRMZM2G055024、AC233950.1（Tb1）屬于Tb1類TCP家族基因。玉米Tb1和BAD1基因都與植物器官的三維形態(tài)發(fā)育及極性調(diào)控相關(guān)。因此GRMZM2G064628、GRMZM2G055024也可能影響玉米器官的三維形態(tài)發(fā)育及極性的建立。

玉米、水稻和擬南芥這3個物種的共計40多個TCP家族基因分散在進化樹的各個大小分支，說明TCP家族基因擴增事件在物種分化尤其是單雙子葉植物分化之前就已發(fā)生。而GRMZM2G064628和GRMZM2G110242在第二大類里單獨聚為一個小分支，說明物種形成之后玉米在ClassⅡ TCP家族基因中發(fā)生了明顯的基因擴增事件，這兩個基因可能與玉米特有的生物性狀相關(guān)。由于ClassⅡ家族基因的大部分成員同一物種發(fā)生聚類，因此推測ClassⅡ家族在進化后期逐漸形成，可能屬于年輕的一類，而ClassⅠ屬于古老的一類，ClassⅡ可能由ClassⅠ的成員進化而來。

蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，7個玉米TCP家族轉(zhuǎn)錄因子均含有TCP家族中最保守的兩個基序：motif 1和motif 2。GRMZM2G148022與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242一樣都有motif 6這個特異的保守基序，但其排列順序卻與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242不同，進化上GRMZM2G148022與GRMZM2G064628和GRMZM2G110242也存在差異，屬于兩個大的分支，因此推測功能上也存在差異。

本研究為玉米TCP基因家族的功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為其進化研究提供了理論依據(jù)。

參 考 文 獻：

[1] Cubas P， Lauter N， Doebley J， et al. The TCP domain： a motif found in proteins regulating plant growth and development [J]. Plant Journal， 1999a， 18（2）： 215-222.

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