孫 勇，陳寶君，勒 娟，潘曉峰，張 方

(1. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬淮海醫(yī)院燒傷科，江蘇徐州 221004；2. 中國人民解放軍第九七醫(yī)院燒傷科，江蘇徐州 221004)

◇基礎(chǔ)研究◇

含hITF基因cDNA的腺病毒載體的構(gòu)建及其感染腸上皮細(xì)胞的研究

孫 勇，陳寶君，勒 娟，潘曉峰，張 方

(1. 徐州醫(yī)學(xué)院附屬淮海醫(yī)院燒傷科，江蘇徐州 221004；2. 中國人民解放軍第九七醫(yī)院燒傷科，江蘇徐州 221004)

目的 構(gòu)建含有人腸三葉因子基因cDNA的腺病毒載體，并觀察其對腸上皮細(xì)胞的感染能力。方法 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增hITF基因cDNA全長序列，測序后亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1大腸桿菌株BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，內(nèi)切酶PmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝及擴(kuò)增，并進(jìn)行滴度測定。將重組腺病毒感染腸上皮細(xì)胞(HT-29)，熒光顯微鏡觀察感染效果。結(jié)果 成功構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF，PmeⅠ線性化后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組，PacⅠ酶切鑒定后命名為Ad-hITF；重組腺病毒載體在HEK293細(xì)胞中包裝，獲得重組腺病毒顆粒；根據(jù)Karbers公式計算病毒顆粒滴度為2×109pfu/mL；重組腺病毒可以感染腸上皮細(xì)胞(HT-29)，感染效率較高。結(jié)論 成功構(gòu)建含hITF基因cDNA的重組腺病毒載體并獲得大量子代重組腺病毒，為腺病毒介導(dǎo)hITF基因治療的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

腸三葉因子；腺病毒；腸上皮細(xì)胞；基因治療

人腸三葉因子(human intestinal trefoil factor, hITF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有胃腸道保護(hù)和修復(fù)作用的小分子蛋白，它由59個氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量約6.7×103，屬于三葉肽家族[1-2]。hITF包含一個由38～39個氨基酸殘基組成的特殊保守序列，其中的6個半胱氨酸按1～5、2～4、3～6的順序依次形成3個二硫鍵，從而產(chǎn)生特異而穩(wěn)定的三葉草型結(jié)構(gòu)[3]。作為一個具有廣泛應(yīng)用前景的藥物前體，卻因為復(fù)雜的制備過程、較低的產(chǎn)量限制了它的應(yīng)用?；蛑委熓墙陙沓霈F(xiàn)的嶄新的治療手段，是將人正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)[4-5]。腺病毒是目前應(yīng)用最為廣泛的基因傳遞載體之一[6-7]。本研究采用第3代腺病毒傳遞hITF基因，并感染腸上皮細(xì)胞(HT-29)，為腺病毒介導(dǎo)hITF基因治療的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、酶和主要試劑 質(zhì)粒pEGFP-N1、腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV、骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(存在于大腸桿菌BJ5183中)、大腸桿菌E.coliDH5α和人胚胎腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)由本實驗室保存。T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、BglⅡ、NotⅠ、KOD-Plus酶均購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ購自美國Biolab公司；脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 hITF真核表達(dá)載體的構(gòu)建 hITF的信號肽+成熟肽cDNA編碼區(qū)的大小為219 bp，編碼73個氨基酸。根據(jù)在GenBank檢索得到的hITF mRNA序列(NM003226)，使用Primer 5.0軟件設(shè)計以下引物：引物1：5′-GAGACTCGAGATGCTGGGGCTGGTCCTGG-3′，引物2：5′-TTTAGAATTCGGAAGGTGCAT-TCTGCTTC-3′。上游和下游引物分別引入XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位點(下劃線)，為了閱讀框正確，引物2添加堿基G(加粗)。PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切后與同樣雙酶切的pEGFP-N1相連。

1.3 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒pEGFP-N1-hITF與腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上具有相同的內(nèi)切酶位點BglⅡ、NotⅠ，經(jīng)相同的兩種內(nèi)切酶酶切后，兩種質(zhì)粒分別產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，在T4DNA連接酶的作用下，目的基因hITF與腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV相連。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取卡那抗性菌落抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切和測序鑒定。

1.4 腺病毒同源重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF 經(jīng)PmeⅠ線性化，與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，卡那霉素瓊脂平板篩選，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑陽性克隆提質(zhì)粒，PacⅠ酶切鑒定。

1.5 重組腺病毒的包裝 取5 μg的pAdEasy-hITF DNA用限制性內(nèi)切酶PacⅠ消化，使用DNA純化回收試劑盒，回收酶切產(chǎn)物，測量濃度后-20 ℃貯存?zhèn)溆?。脂質(zhì)體介導(dǎo)pAdEasy-hITF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，劑量為5 μgPacⅠ酶切回收產(chǎn)物：10 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體，6 h后更換為完全培養(yǎng)基；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染腺病毒載體8～10 d之后可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變圓等典型CPE現(xiàn)象，即為第1代病毒；快速反復(fù)凍融4次后全部加入至6孔板的HEK293細(xì)胞中；2～3 d后細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，待大部分細(xì)胞變圓漂浮，按前述方法收集病毒上清，如此反復(fù)感染擴(kuò)增，收集病毒，為第2代病毒；重復(fù)上述步驟將重組腺病毒在293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增3輪后純化，即得到高滴度的重組腺病毒。

1.6 腺病毒的滴度測定(TCID50法) 取病毒液200 μL，將病毒液用DMEM培養(yǎng)液稀釋至10-1倍，病毒液的體積變?yōu)? mL；從其中取出200 μL，將這200 μL 再稀釋10倍，此時病毒液的體積為2 mL，而病毒液的濃度為原液的10-2倍；依次類推，直至稀釋至10-10，共10管，各管有病毒液1.8 mL；在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)293細(xì)胞；滴加病毒情況如下：第1行滴加10-10的病毒液，第2行滴加10-9，依次類推，到第8行時病毒液的稀釋倍數(shù)為10-3，每行的第11、12列不加病毒液，以作對照用；于培養(yǎng)后第10天顯微鏡下觀察各孔，以培養(yǎng)孔中出現(xiàn)CPE現(xiàn)象為陽性，計數(shù)陽性細(xì)胞孔數(shù)。根據(jù)Karbers公式計算所測樣本病毒載體滴度：腺病毒載體滴度=101+1(陽性數(shù)-0.5) +1TCID50/mL=101+1(陽性數(shù)-0.5)+1-0.7pfu/mL。

1.7 重組腺病毒感染腸上皮細(xì)胞 HT-29細(xì)胞采用含100 mL/L FCS的DMEM培養(yǎng)液，青霉素、鏈霉素各100 U/mL，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)，細(xì)胞隔天換液一次，每3～4 d進(jìn)行傳代，傳代比例為1∶3，選取形態(tài)好的細(xì)胞用于實驗研究。腸上皮細(xì)胞接種于6孔板細(xì)胞，以MOI值50計算所需病毒載體量；以新鮮培養(yǎng)液漂洗6孔板的細(xì)胞2次，將病毒加入至6孔板中，新鮮培養(yǎng)液補(bǔ)足至2 mL，37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF的雙酶切鑒定 將質(zhì)粒pEGFP-N1-hITF、腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV雙酶切，連接過夜并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)。隨機(jī)挑選2個菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)BglⅡ、NotⅠ雙酶切后，切出996 bp大小的片段，證實為陽性克隆(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.1 Identification of recombinant plasmid with enzyme digestion

1：DL2000 Marker; 2, 3: Identification withBglⅡ andNotⅠ; 4:λDNA/HindⅢ。

2.2PacⅠ酶切鑒定 將穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒同源重組后，長出數(shù)十個大中小號菌落，任意挑選8個中小號菌落搖菌、提質(zhì)粒，用8 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析。結(jié)果8個重組質(zhì)粒大小均和骨架質(zhì)粒pAdEasy-1接近，考慮可能全部重組成功(圖2)。任意挑選5號質(zhì)粒用PacⅠ酶切進(jìn)行鑒定。如果右臂和左臂同源重組，重組腺病毒質(zhì)粒用PacⅠ酶切可產(chǎn)生4.5 kb左右的片段；如果右臂與ori同源重組，則PacⅠ酶切后產(chǎn)生大小約3.0 kb的片段。本實驗酶切出一約3.0 kb大小的片段，故證明該腺病毒質(zhì)粒重組成功，遂命名Ad-hITF(圖3)。

圖2 重組腺病毒載體的電泳圖

Fig.28 g/L agarose gel electrophoresis of recombinant adenoviral vector

M: λDNA/HindⅢ; 1: pAdTrack-CMV-hITF; 2～10: Ad-hITF。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid with enzyme digestion

1: λDNA/HindⅢ; 2: Identification of Ad-hITF withPacⅠ; 3:Ad-hITF。

2.3 重組腺病毒的包裝

2.3.1 第一輪(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染) 線性化的腺病毒載體在Lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，2 d后出現(xiàn)發(fā)綠色熒光細(xì)胞，此時光鏡下部分細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變；5 d左右發(fā)光細(xì)胞大量增加，視野內(nèi)熒光密集、明亮，成團(tuán)出現(xiàn)；10 d之后全部細(xì)胞變成綠色，光鏡下可觀察到大量細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變圓等典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，部分細(xì)胞呈葡萄串樣聚集，部分細(xì)胞變圓后漂浮(圖4)。

2.3.2 第二輪 將第一輪包裝病毒的上清液，繼續(xù)感染 HEK293 細(xì)胞，以進(jìn)一步提高滴度。如圖所示，第二輪感染后1 d，出現(xiàn)較多的綠色細(xì)胞，此時細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化；2 d后，綠色細(xì)胞大量、成團(tuán)出現(xiàn)，部分細(xì)胞腫脹、變圓；3 d后，幾乎所有細(xì)胞變綠，熒光強(qiáng)度高，大量細(xì)胞變圓、漂起(圖5)。

2.4 重組腺病毒滴度的測定 TCID50(Tissue culture infective dose 50，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)，即指能在半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)板孔或試管內(nèi)引起CPE的病毒量。本研究在HEK293細(xì)胞接種腺病毒后10 d，觀察到在10-3、10-4稀釋度的樣本中全部HEK293細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，而10-10稀釋度則沒有出現(xiàn)CPE現(xiàn)象。按Karbers公式計算擴(kuò)增所得腺病毒的滴度為=101+1(1+1+1+1+1+1+1+1+0.5+0-0.5)+1TCID50/mL=1010TCID50/mL或者=109.3pfu/mL=2×109pfu/mL。

2.5 熒光顯微鏡觀察 重組腺病毒在MOI=50條件下感染HT-29細(xì)胞(3d)，感染率較高，而細(xì)胞形態(tài)光鏡下沒有變化(圖6)。

圖4 重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞(第一代)

Fig.4 Infection of HEK293 cell with recombinant adenoviruses (the first generation) (×100)

線性化的腺病毒載體在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，照片拍攝于轉(zhuǎn)染后2(A、D)、5(B、E)、10(C、F)d。A、B、C：為可見光；D、E、F：為綠色熒光。

圖5 重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞(第二代)

Fig.5 Infection of HEK293 cell with recombinant adenoviruses (the second generation) (×100)

將第一代腺病毒繼續(xù)感染HEK293細(xì)胞，用于制備第二代腺病毒，照片拍攝于感染后1(A、D)、2(B、E)、3(C、F)d；A、B、C：為可見光；D、E、F：為綠色熒光。

3 討 論

本研究中我們使用的是第3代腺病毒，與其他類型基因傳遞載體比較，腺病毒載體具有以下優(yōu)點：宿主范圍廣、安全、滴度高、多基因表達(dá)、穩(wěn)定、外源基因容量大、可高水平介導(dǎo)外源基因表達(dá)、可感染增殖和非增殖細(xì)胞、與人類基因同源性以及免疫途徑簡便[8-10]。我們首先將hITF基因cDNA與穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)相連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-hITF。pAdTrack-CMV同樣含有GFP報告基因，以方便檢測與觀察。然后將重組穿梭質(zhì)粒線性化后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-hITF。對于腺病毒的構(gòu)建，以前多采用細(xì)胞內(nèi)同源重組法重組腺病毒在MOI=50條件下感染HT-29細(xì)胞，感染后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，照片拍攝于感染后3 d；A：綠色熒光；B：細(xì)胞核；C：A和B融合后。

圖6 腺病毒Ad-hITF感染HT-29細(xì)胞(3 d)

Fig.6 Infection of HT-29 cell with recombinant Ad-hITF (3 d)

(雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染)，即將帶有目的基因的穿梭載體小質(zhì)粒和帶有腺病毒基因組的大質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞：HEK293細(xì)胞，這兩種質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)通過隨機(jī)的同源重組，形成重組腺病毒載體基因組，并包裝成具有感染性的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。此方法的缺點是效率較低，費(fèi)時費(fèi)力。我們使用的AdEasyTM系統(tǒng)是新近構(gòu)建的，即將含有外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至攜帶有腺病毒骨架質(zhì)粒的大腸桿菌，在細(xì)菌Cre重組酶的作用下發(fā)生同源重組，獲得重組腺病毒載體質(zhì)粒，重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，在其中包裝成重組病毒顆粒。此方法重組過程在大腸桿菌內(nèi)完成，操作相對簡單、效率較高，同源重組率在60%以上，因而目前得到較廣泛的應(yīng)用[11-13]。

在成功構(gòu)建并包裝出重組腺病毒Ad-hITF后，我們將其感染人腸上皮細(xì)胞。人腸上皮細(xì)胞由于每天要經(jīng)歷頻繁的機(jī)械摩擦和接觸大量的刺激物質(zhì)，如酸、堿、食物，甚至細(xì)菌，因此保證細(xì)胞間的緊密連接至關(guān)重要，腸上皮細(xì)胞的這種特征也決定了它的難轉(zhuǎn)染性。預(yù)實驗證明MOI=50的病毒滴度即可以達(dá)到最大的感染效率，而此時細(xì)胞也沒有因為病毒感染產(chǎn)生病變。因此，我們選擇MOI=50的病毒滴度進(jìn)行細(xì)胞感染，熒光顯微鏡觀察提示，此時重組腺病毒的感染率較高，同時細(xì)胞形態(tài)和正常細(xì)胞完全一樣，生長速度、粘附力均未發(fā)生變化。

總之，本研究成功構(gòu)建了含hITF基因cDNA的重組腺病毒載體并獲得大量子代重組腺病毒，為腺病毒介導(dǎo)hITF基因治療的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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(編輯 韓維棟)

Construction of recombinant adenovirus vector containing hITFand infection of intestinal epithelial cells

SUN Yong, CHEN Bao-jun, LE Juan, PAN Xiao-feng, ZHANG Fang

(1.Department of Burn Surgery, Huaihai Hospital Affiliated to Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004; 2. Department of Burn Surgery, No.97 Hospital of PLA, Xuzhou 221004, China)

Objective To construct a recombinant adenovirus vector of human intestinal trefoil factor (hITF) and to determine its infection efficiency in human intestinal epithelial cells (HT-29). Methods The genomic fragment of hITF was amplified by PCR and subcloned into adenovirus shuttle plasmid to construct recombinant vector. Homologous recombination was performed by transferring the recombinant vector toE.coliBJ5183 containing the backbone pAd-Easy. The correct recombinant was selected and linearized withPmeⅠ, and then transfected into 293 cells for packaging and amplification. The titration of the recombinant adenovirus was determined. Human colon adenocarcinoma cell line (HT-29) was infected with recombinant adenovirus and infection efficiency was determined. Results The recombinant vector pAdTrack-CMV-hITF was constructed. After digestion with restriction enzymePmeⅠ, linearized recombinant vector was transformed into BJ5183 bacteria and the adenoviral plasmid Ad-hITF carrying hITF was generated with homologous recombination. The mature viruses would be packaged in 293 cells. The titer of the viruses was 2×109pfu/mL by TCID50 method. Transfection efficiency in HT-29 was high. Conclusion Recombinant adenovirus vector containing hITF gene has been successfully constructed and this research lays foundations for further application of hITF gene therapy.

intestinal trefoil factor; adenovirus; intestinal epithelial cell; gene therapy

2014-03-28

2014-06-09

國家自然科學(xué)基金資助項目(81100252)；南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科研課題重點項目(12Z10) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81100252) and the Scientific Research Funds of Nanjing Military Command (12Z10)

孫勇，博士，副主任醫(yī)師，主要從事燒傷后胃腸黏膜損傷與修復(fù)的研究. E-mail: sunyong_97@sina.com

時間：2014-09-19 17∶16 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140919.1716.007.html

R379；R394.3

A

10.7652/jdyxb201406013