楊 蕓，李 昆，李 薇，郭 鑫，王 超，宋富強(qiáng)，周龍甫，呼永河

高濕環(huán)境致大鼠腎功能損害與水通道蛋白-2的表達(dá)

楊 蕓，李 昆，李 薇，郭 鑫，王 超，宋富強(qiáng)，周龍甫，呼永河

目的 觀察高濕環(huán)境對SD大鼠腎功能的影響，探討水通道蛋白-2(AQP2)和加壓素受體-2(V2R)在高濕環(huán)境大鼠腎臟中的表達(dá)及其意義。方法 20只SD大鼠隨機(jī)分為對照組和高濕組，每組10只。高濕組大鼠每日放入人工氣候箱10 h[溫度25 ℃，相對濕度(RH)為(90±2)%]，對照組置常溫常濕環(huán)境[溫度(25±2)℃，RH(55±5)%]。處理20 d后，熒光定量PCR檢測腎髓質(zhì)AQP2和V2R mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測腎髓質(zhì)AQP2、磷酸化AQP2(p-AQP2)以及V2R的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，高濕組大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)顯著升高(P<0.05)；腎髓質(zhì)AQP2和V2R mRNA表達(dá)較對照組顯著降低(P<0.01)，AQP2、V2R的蛋白表達(dá)水平和AQP2的磷酸化水平較對照組顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 高濕環(huán)境可對大鼠腎功能造成一定損害,且使V2R和AQP2的表達(dá)水平降低，AQP2磷酸化水平也降低，提示V2R和AQP2可能參與了高濕環(huán)境引起的腎功能損害的發(fā)生發(fā)展。

高濕環(huán)境；腎功能；水通道蛋白-2；加壓素受體-2；磷酸化

環(huán)境因素如溫度、濕度等對機(jī)體有重要影響[1]，高濕環(huán)境與高寒、高熱環(huán)境一樣，可對機(jī)體造成損傷，是誘使疾病發(fā)作的重要因素之一。研究表明，腎功能受損可能與腎髓質(zhì)AQP2的表達(dá)相關(guān)[2]。水通道蛋白-2(AQP2)是加壓素(vasopresin，VP)依賴性水通道蛋白，在腎調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡時(shí)發(fā)揮重要作用。加壓素受體-2(V2R)分布于腎臟集合管主細(xì)胞的基底側(cè)膜，通過激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)使AQP2磷酸化并重新分布，從而調(diào)節(jié)集合管對水的通透性。本研究通過觀察高濕環(huán)境對大鼠腎功能、腎髓質(zhì)AQP2和VP通路受體V2R表達(dá)的影響，探討高濕環(huán)境致腎功能損害的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備 Western blot一抗兔抗大屬多克隆AQP2抗體購自ImmunoWay(YT0290)公司，p-AQP2與V2R兔抗大鼠多克隆抗體購自北京博奧森抗體公司(bs-12507R/bs-1705R)，GAPDH抗體購于上?？党缮锕?KC-5G5)，二抗羊抗兔(A0208)購自碧云天生物技術(shù)研究所；TRIzol(R0016)購自碧云天生物技術(shù)研究所； 一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒(RR086A)購自TAKARA公司， CFX96 PCR儀(BIO-RAD)；人工氣候箱(RXZ-1000A，寧波江南儀器廠)。

1.2 動(dòng)物模型 20只SPF級雄性SD大鼠，健康狀況良好，平均體重200～220 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號：SCXK(川)2004]，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組10只，環(huán)境實(shí)驗(yàn)條件：溫度(25±2) ℃，相對濕度RH為(50±5)%；高濕組10只：采用人工氣候箱模擬高濕環(huán)境，設(shè)置條件：溫度25 ℃，RH為(90±2)%，10 h/d，共20 d。

1.3 腎功能檢測及腎臟取材 用加入EDTA的抗凝管采集每只活體大鼠的腹主動(dòng)脈血液，離心收集血清后，BECKMAN COULTER AU5800全自動(dòng)生化儀檢測腎功能指標(biāo)(BUN、SCr)；分別取兩組大鼠的腎臟，輕輕剝離腎表面膜，分離左腎髓質(zhì)，于液氮中速凍后存于-80 ℃冰箱，以備后續(xù)做AQP2及V2R分子檢測。

1.4 AQP2和V2R的mRNA表達(dá)水平檢測 按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，取40 ng RNA做實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測，步驟及轉(zhuǎn)錄條件嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，肌動(dòng)蛋白β-actin為內(nèi)參。引物序列如下:AQP2上游引物：TTGCAGGAACCAGACACTTG，下游引物:GCGGAGACGAGCACTTTTAC；V2R上游引物:TGTGGCTCTGTTTCAAGTGC，下游引物:GCCAGGATCATGTAGGAGGA；β-actin 上游引物:ACGGTCAGGTCATCACTATCG，下游引物:GGCATAGAGGTCTTTACGGATG。

1.5 AQP2、p-AQP2和V2R的蛋白表達(dá)測定 常規(guī)提取左腎髓質(zhì)總蛋白，BCA法定量，以每孔50 μg上樣量為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH為內(nèi)參。其后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%的BSA封閉膜，進(jìn)行免疫結(jié)合，之后采用ECL發(fā)光法在暗室內(nèi)膠片曝光成像。使用Image plus 5.0檢測條帶灰度值，并分別與相應(yīng)GAPDH灰度值相比，灰度值之比作為檢測樣本的蛋白相對含量。

2 結(jié)果

2.1 高濕環(huán)境對大鼠腎功能的影響 高濕環(huán)境下，大鼠腎功能兩項(xiàng)指標(biāo)BUN、SCr相比正常組明顯升高(P<0.05，表1)。

表1 兩組BUN、SCr及AQP2和V2R的mRNA水平的比較(n=10)

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.2 高濕環(huán)境對腎髓質(zhì)AQP2和V2R的mRNA水平的表達(dá)影響 與對照組相比，高濕組AQP2和V2R的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01，表1)。

2.3 高濕環(huán)境對AQP2、p-AQP2和V2R蛋白表達(dá)水平的影響 高濕組AQP2和V2R較對照組的蛋白表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01，圖1)，且p-AQP2較對照組表達(dá)降低尤為顯著。分析結(jié)果顯示，高濕組AQP2蛋白表達(dá)較對照組降低39.02%，而p-AQP2較對照組表達(dá)降低68.75%(表2)。

圖1 大鼠腎髓質(zhì)AQP2、p-AQP2和V2R的半定量分析AQP2分子量26 kDa，p-AQP2 分子量29 kDa，V2R 分子量40 kDa，GAPDH 分子量36 kDa

表2 兩組AQP2、P-AQP2、V2R的光密度倍比值比較

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

3 討論

高濕環(huán)境下動(dòng)物的腎臟、肺和皮膚等都會(huì)出現(xiàn)不同程度損傷[3]，但其機(jī)制尚未明了。本研究通過對高濕環(huán)境下大鼠腎功能的檢測，發(fā)現(xiàn)BUN、SCr兩項(xiàng)指標(biāo)顯著升高，提示高濕環(huán)境大鼠的腎功能受到損害。

已有研究發(fā)現(xiàn)，AQP2的表達(dá)變化與腎功能明顯相關(guān)[4]，而其表達(dá)的調(diào)節(jié)依賴于適度的VP分泌水平，VP通過與V2R的結(jié)合，一方面促進(jìn)AQP2插入到頂部質(zhì)膜區(qū)域，另一方面通過增強(qiáng)AQP2的磷酸化作用，促使腎集合管對水的通透性增強(qiáng)[5-7]。腎集合管內(nèi)皮細(xì)胞在接收VP刺激信號前，AQP2一直處于細(xì)胞表面稱作“入胞-抵抗”的膜區(qū)域的動(dòng)態(tài)平衡中，VP分泌的改變使AQP2在“入胞-抵抗”的平衡區(qū)域發(fā)生運(yùn)動(dòng)，同時(shí)其磷酸化的水平也相應(yīng)變化[8]。李紅芬等[9]認(rèn)為，p-AQP2表達(dá)與髓質(zhì)纖維化、炎細(xì)胞浸潤程度呈負(fù)相關(guān)，提示大鼠腎臟p-AQP2的表達(dá)降低可能誘導(dǎo)髓質(zhì)纖維化，炎細(xì)胞浸潤程度升高，致使腎功能受損。Di等[10]發(fā)現(xiàn)，AQP2與腎臟集合管水平衡控制、細(xì)胞遷移分化等進(jìn)程緊密相關(guān)，AQP2表達(dá)降低可誘使腎髓質(zhì)細(xì)胞遷移分化進(jìn)程異常，導(dǎo)致腎功能程度性受損。高濕環(huán)境下，腎功能兩項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)增高，AQP2和V2R在mRNA和蛋白水平都相應(yīng)降低，且AQP2的磷酸化水平相比總蛋白降低更為顯著，提示高濕環(huán)境腎功能受損。從AQP2和V2R的表達(dá)降低，可推斷整個(gè)機(jī)體通過腎臟呈現(xiàn)出對水轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制狀態(tài)；磷酸化AQP2的水平降低，說明分布于腎集合管頂部質(zhì)膜的活性AQP2分子十分有限。以上結(jié)果都提示，高濕環(huán)境下腎臟對水的重吸收功能出現(xiàn)障礙，這種障礙的產(chǎn)生與AQP2的表達(dá)和磷酸化水平有著重要聯(lián)系。有研究報(bào)道，AQP2的表達(dá)改變先于SCr和BUN的變化，可作為腎功能損害的早期觀測指標(biāo)[11-12]。據(jù)此推測，高濕環(huán)境對腎功能損害發(fā)生在V2R和AQP2改變之后，AQP2可以作為高濕環(huán)境對腎損傷的重要檢測指標(biāo)。

總之，通過對高濕環(huán)境下大鼠腎功能、AQP2和V2R三者的監(jiān)測，加深了對高濕環(huán)境腎功能損傷的認(rèn)識，推測其影響機(jī)制是通過V2R-AQP2這一通路來實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持這樣的推論，在高濕環(huán)境下，大鼠腎功能一定程度受損，V2R和AQP2的表達(dá)水平降低，AQP2的磷酸化水平也降低。但是，高濕環(huán)境是如何影響機(jī)體激素的變化，機(jī)體VP的水平到底隨高濕如何改變，是否存在其他通路導(dǎo)致?lián)p傷的發(fā)生，目前這些都不太清楚，需進(jìn)一步研究。

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Influence of high humidity environment on rats' renal function lesion and the expression of aquaporin protein-2

Yang Yun1,Li Kun1,Li Wei1,Guo Xin1,Wang Chao2,Song Fuqiang1,Zhou Longfu3,Hu Yonghe1

1.Central Laboratory;2.Department of Laboratory;3.Department of Medical Engineering,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To observe the influence of high humid environment on SD rats' renal function,and to discuss the expression and significance of aquaporin protein-2(AQP2)and vasopressin receptor-2(V2R)in rats' kidneys in high humidity environment.Methods Twenty SD rats were randomly divided into control and high humidity groups with 10 ones in each group.The rats in the high humidity group were carried daily into artificial climatic cabinet for 10 hours[the temperature was 25 ℃,and the relative humidity was(90±2)%].The rats in the control group were put in the environment with common temperature[the temperature was(25±2)℃,and the RH was (55±5)%].After 20 d,fluorescent quantitation PCR was used to detect the mRNA expression levels of renal medull AQP2 and V2,and Western blotting method was used to detect the protein expression levels of AQP2,phosphorylated AQP2(phosphorylation of aquaporin protein-2,p-AQP2),and V2R.Results Compared with control group,the blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)in the high humidity group significantly increased compared with those indexes in the control group(P<0.05).The mRNA expression levels of renal medulla AQP2 and V2R and the protein expression levels of AQP2,p-AQP2,and V2R in the high humidity group all significantly decreased compared with those levels in the control group [(P<0.01)and(P<0.05)].Conclusion High humidity environment can cause damage of the renal function of the rats and decrease the expression levels of V2R and AQP2 and the phosphorylation level of AQP2,which indicates that V2R and AQP2 may be involved in the development of renal function lesion caused by the humid environment.

high humidity environment;renal function;aquaporin protein-2;vasopressin receptor-2;phosphorylation

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J067)

610083 成都,成都軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(楊 蕓，李 昆，李 薇，郭 鑫，宋富強(qiáng))，檢驗(yàn)科(王 超)，醫(yī)學(xué)工程科(周龍甫)；成都軍區(qū)總醫(yī)院(呼永河)

呼永河,E-mail:huyonghe@mvip.126.com

R 692

A

1004-0188(2014)02-0123-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.003

2013-12-25)