張小燕，丁曉萍，葉 梅,徐海燕，卞美璐，陳慶云

莪術油對人乳頭狀瘤病毒的抑制作用

張小燕1，丁曉萍1，葉 梅1,徐海燕1，卞美璐2，陳慶云2

目的探討莪術油對人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16亞型的抑制作用。方法以不同濃度的含莪術油培養(yǎng)液體外培養(yǎng)宮頸癌細胞系SiHa、CaSki 和宮頸永生化細胞H8，相差顯微鏡下觀察活細胞形態(tài)學變化；采用四甲基偶氮唑藍比色法、流式細胞術檢測不同濃度莪術油對細胞增殖的影響；應用反轉錄-聚合酶鏈反應技術(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測人乳頭狀瘤病毒HPV16亞型 E6E7的表達。結果不同濃度的莪術油可以抑制細胞的增殖；莪術油作用于SiHa細胞，G1期細胞減少(P<0.05)，G2、S期細胞增加(P<0.01)，細胞阻滯于G2、S期。莪術油作用于CaSki 、H8細胞，G1期細胞減少(P<0.01)，S期細胞增加(P<0.01)，使細胞阻滯于S期。加藥組SiHa、CaSki和H8細胞凋亡率高于對照組，有統(tǒng)計學差異(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；三種細胞HPV16E6E7基因片段mRNA表達均明顯低于對照組(P<0.01)。結論莪術油在體外抑制宮頸癌細胞系SiHa、CaSki 和宮頸永生化細胞H8增殖，其機制可能是通過抑制HPV16E6E7表達而抑制細胞生長。

莪術油；人乳頭狀瘤病毒；反轉錄-聚合酶鏈反應

宮頸癌是最常見的惡性腫瘤之一，目前已經(jīng)明確高危型人乳頭狀瘤病毒感染是宮頸癌和癌前病變的主要危險因素[1]，與宮頸癌有關的高危HPV亞型的治療目前尚無特效藥物，HPV疫苗大規(guī)模投入臨床使用尚需時日，研制開發(fā)抗HPV藥物對于宮頸癌的防治具有重要意義。莪術屬姜科植物的干燥根莖，經(jīng)溫莪術蒸餾得到的揮發(fā)油-莪術油在抗病毒和腫瘤治療中表現(xiàn)出良好的效果，故受到關注[2,3]。但是，莪術油對于宮頸病變相關的高危型HPV作用的研究報道甚少。本研究旨在探討中藥莪術油對于HPV16抑制作用的機制，為臨床對宮頸癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 細胞系 CaSki細胞系,HPV16陽性的人宮頸癌細胞株，H8細胞系，人宮頸鱗狀上皮永生化細胞系，HPV16 陽性細胞株，SiHa細胞系，HPV16 陽性細胞株，以上均由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所生物物理室提供。

1.1.2 引物 由上海生工生物工程技術服務有限公司應用美國PE公司391型 DNA自動合成儀合成。

1.1.3 試劑 莪術油，由海南碧凱藥業(yè)有限公司提供；培養(yǎng)液和血清：Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)液(GIBCO BRL)，胎牛血清(天津市川頁生化制品有限公司)；工具酶：Taq DNA 聚合酶(Promega)，反轉錄酶(AMV Reverse Transcriptase)(Promega)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CaSki和SiHa細胞在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，H8細胞在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃， 5% CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察 將對數(shù)生長期的細胞接種于預先放置玻片的6孔板培養(yǎng)板內，每孔10×104個細胞，分為4個組(對照組，藥物1-3組，藥物濃度分別為15、25、35 μg/ml),形成附有細胞的蓋片，培養(yǎng)3 d后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 細胞生長抑制情況 將細胞接種于六板96孔細胞培養(yǎng)板，每孔3000個細胞，第2天更換為含藥培養(yǎng)液，分4組，方法同上，每個濃度平行5孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg/ml四甲基偶氮唑藍(MTT)20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl, 37 ℃培養(yǎng)20 min，酶標儀測定OD值，波長492 nm，連續(xù)6 d，記錄生長曲線。

1.2.4 細胞周期檢測 在六孔培養(yǎng)板中以含不同濃度藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，分4組，方法同上，每個藥物濃度平行3孔，收集細胞，制備單細胞懸液，PBS清洗2次，預冷70%乙醇固定，4℃保存待檢。經(jīng)0.01%RNA酶處理胞漿RNA、50 μg/ml碘化丙錠(propidium iodide, PI)DNA染色30 min后，經(jīng)300篩目過濾除去成團細胞，應用流式細胞儀檢測細胞周期中不同時相的細胞百分比和細胞凋亡率。每份標本測定5000個細胞。根據(jù)DNA含量區(qū)分細胞所處細胞周期時相。

1.2.5 mRNA表達檢測 收集培養(yǎng)第5天的細胞，TRIZOL處理后提取RNA,反轉錄為cDNA，擴增HPV16E6、E7，同時擴增β-actin作為內參照，HPV16E6、E7引物(616 bp)：上游5′-TGACTTTGCTTTTCGGGATT-3′,下游5′-GAGAACAGATGGGGCACAC-3′。β-actin(552 bp)引物序列：上游：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3′,下游：5′-CATGGTGGTGCCGCCGCCAGACAG-3′。擴增參數(shù)為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)；72 ℃延伸加時5 min；PCR產物4 ℃保存； 2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，電壓40 V。應用Scion Image 4.0 (NIH)軟件進行電泳條帶圖像灰度值的半定量分析。待測基因電泳條帶灰度比值=待測條帶灰度值/同一份標本內參照β-actin條帶灰度值。每個加藥樣本至少檢測3次。

2 結 果

2.1 莪術油對細胞的生長抑制作用 MTT檢測發(fā)現(xiàn)， SiHa在莪術油作用第1天開始，不同藥物濃度與空白對照吸光度值(OD)有顯著性差異(P<0.01)，并呈劑量依賴性(圖1)。H8與SiHa相似。而CaSki在藥物作用第2天開始，不同藥物濃度與空白對照吸光度值(OD)差異有顯著性(P<0.01)，并呈劑量依賴性。計算莪術油作用第5天SiHa、H8、CaSki 50%抑制濃度(IC50)分別為25.6、31.4、33.8 μg/ml，其中SiHa對藥物的敏感性最高。

圖1 莪術油作用下各組SiHa細胞生長曲線

2.2 藥物對細胞形態(tài)的影響 SiHa細胞用莪術油處理后，可見細胞生長稀疏，部分細胞固縮(圖2，3)。莪術油對CaSki 和H8細胞也有相似作用。

2.3 莪術油作用下細胞周期和凋亡率 莪術油作用于SiHa細胞，G1期細胞減少(P<0.05)，G2、S期細胞增加(P<0.01)，細胞阻滯于G2、S期。莪術油作用于CaSki、H8細胞，G1期細胞減少，(P<0.01)，S期細胞增加(P<0.01)，使細胞阻滯于S期。在莪術油作用下，SiHa、 CaSki和H8細胞凋亡率高于對照組，有統(tǒng)計學差異(P<0.01，P<0.01，P<0.05，表1)。

圖2 SiHa細胞對照組(HE，×200)

2.4 莪術油對HPV E6E7基因表達的影響 本實驗中在不同濃度莪術油作用下，SiHa、CaSKi、H8 HPV16E6E7基因片段mRNA表達均明顯低于對照組(P<0.01)，并呈劑量依賴關系(P<0.01，表2，圖4-6)。

圖3 SiHa細胞加藥組(35 μg/ml)(HE，×200)

表1 莪術油作用下細胞周期分布和細胞凋亡率

注：與對照組相比，①P<0.05,②P<0.01；藥物1-3組，藥物濃度分別為15、25、35 μg/ml

表2 RT-PCR產物電泳條帶灰度值 ；n=3)

注：藥物1-3組，藥物濃度分別為15、25、35 μg/mL

圖4 不同濃度莪術油作用下SiHa細胞系HPV16E6E7表達

圖5 不同濃度莪術油作用下CaSKi細胞系HPV16E6E7表達

圖6 不同濃度莪術油作用下H8細胞系HPV16E6E7表達

3 討 論

近年來，從中藥中篩選抗病毒和抗腫瘤藥物是藥物治療研究的熱點。莪術油是經(jīng)溫莪術蒸汽蒸餾得到的揮發(fā)油，含有多種抗癌有效成分，如β-欖香烯、莪術醇、莪術酮、吉瑪酮等，在中藥復方中多有配用。中藥制劑保婦康栓由莪術油和冰片兩味中藥組成，在體外抑制宮頸癌細胞系CaSki 和宮頸永生化細胞H8增殖[4]。本實驗通過研究莪術油對于體外培養(yǎng)的宮頸癌細胞系和宮頸永生化細胞的作用，探討中藥在抗HPV中的作用。

H8細胞系是HPV16陽性的宮頸永生化細胞系，可以作為宮頸癌前病變的體外試驗模型[5]，而SiHa、CaSki是HPV16陽性的宮頸癌細胞系，均為常見的人宮頸病變體外研究模型。莪術油對于SiHa、CaSki和H8細胞的生長具有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強。活細胞照像提示莪術油可以殺傷細胞，細胞生長稀疏，崩解破碎，證實藥物對三種細胞增殖有抑制作用。其中HPV16陽性的SiHa細胞對莪術油的敏感性最高。

凋亡異常是腫瘤形成和進展的重要原因，通過各種途徑和方式誘導增強腫瘤細胞的凋亡，是抑制殺傷腫瘤細胞的重要方面。與細胞凋亡有密切關系的基因有Bcl-2、Fas/FasL、caspases等。Bcl-2是凋亡抑制基因，一旦細胞受到凋亡因子的誘導，Bcl-2向線粒體轉位通過寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道，或開啟線粒體PT孔，導致線粒體中的凋亡因子釋放，激活caspase，導致細胞凋亡[6,7]。Fas及其配體FasL是腫瘤壞死因子受體的超家族成員，F(xiàn)as和FasL被認為是細胞凋亡的誘導因子，在細胞發(fā)生凋亡時，Bcl-2 mRNA轉錄水平顯著降低，APpl·791-系統(tǒng)誘導的凋亡過程是通過Bcl-2表達的負調控Fas來實現(xiàn)的[8]。Fas蛋白與FasL結合后激活caspase，啟動caspases的級聯(lián)反應，導致靶細胞凋亡。在HSC細胞凋亡過程中caspase家族起著重要作用，其中caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的不可替代的終末剪切酶，在凋亡的早期階段，細胞色素C從線粒體釋放，繼而伴caspases激活，活化的caspase-3被裂解相應的胞質胞核底物而激活核酸酶，從而降解DNA，最終導致細胞凋亡[9]。國艷等[10]發(fā)現(xiàn)，莪術油注射液對體外培養(yǎng)的肝星狀細胞有明顯促凋亡作用，可能是通過上調促凋亡基因Fas/FasL的表達，下調抑凋亡基因Bcl-2的表達，使線粒體通透性增加，鏈鎖激活caslyase-3蛋白，而導致細胞凋亡。流式細胞術結果顯示，在不同濃度的莪術油作用下，SiHa、 CaSki和H8細胞凋亡率高于對照組。另外，在莪術油作用下，SiHa細胞阻滯于G2、S期，CaSki 和H8細胞則阻滯于S期，表明莪術油可以通過影響DNA的合成和復制，有效的抑制腫瘤細胞的增殖。研究證實莪術油的成分姜黃素、欖香烯對腫瘤細胞的各個周期都有抑制作用[11]。

本實驗中，在莪術油作用下，SiHa、CaSki、H8三種細胞系HPV16E6E7基因片段mRNA表達均明顯低于對照組，且存在劑量依賴關系。莪術油可能通過抑制腫瘤細胞HPV16E6E7表達，激活P53和Rb通路促進細胞衰老和凋亡。

莪術油在體外抑制宮頸癌細胞系SiHa、CaSki 和宮頸永生化細胞H8增殖，因此莪術油可能是抑制HPV的有效中藥，對于明確為感染性疾病的宮頸癌的防治具有重大的意義，但是其作用機制及臨床療效尚有待進一步探討。

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(2013-07-15收稿 2013-09-22修回)

(責任編輯 梁秋野)

Mechanismofproliferativeinhibitionofoleumcurcumaeonhumanpapillomavirusinvitro

ZHANG Xiaoyan1, DING Xiaoping1, YE Mei1，XU Haiyan1, BIAN Meilu2, and Chen Qingyun2.
1. Department of Obstetrics and Gynecology, The Second Artillery General Hospital of PLA, Beijing100088, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing100029, China

ObjectiveTo study the inhibition of HPV16 by oleum curcumae.MethodsThe human cervical cancer cell line-CaSki, SiHa and the immortalized cervical epithelial cell-H8 were cultured with different concentrations of oleum curcumae. Changes in cellular form were observed by phase contrast microscopy. The proliferative inhibition under different concentrations of oleum curcumae on CaSki, SiHa and H8 was measured by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay and flow cytometry assay. The mRNA expression of HPV16 E6E7 was determined by RT-PCR semi-quantitatively.ResultsThe growth of CaSki, SiHa and H8 was inhibited by different concentrations of oleum curcumae. SiHa cells were accumulated in G2, S phase(P<0.01), while CaSki, H8 cells were accumulated in S phase (P<0.01). The apoptosis rates in CaSki, SiHa and H8 cells were higher than those in control group(P<0.01，P<0.01，P<0.05). After treated by oleum curcumae, CaSki, SiHa and H8 cell showed decreased level of HPV16 E6E7 mRNA than that in the control group (P<0.01).ConclusionsOleum curcumae may execute its antiHPV activity primarily by decreasing the expression of HPV 16E6E7 in cervical cancer cell line and immortalized cervical epithelial cells.

oleum curcumae; human papillomavirus; reverse transcriptase polymerase chain reaction

張小燕，博士，副主任醫(yī)師，E-mail: xiehe2003@sina.com.cn

1. 100088北京，解放軍第二炮兵總醫(yī)院婦產科；2. 100029北京，衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院婦產科

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