丁 維，朱宏建

家族性多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2A型的基因診斷

丁 維1，2，朱宏建1，2

目的提高對多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型(multiple endocrine neoplasia 2, MEN2)的診斷和預測診斷水平。方法對臨床已診斷首發(fā)癥狀為嗜鉻細胞瘤的一個家族內(nèi)兩姐妹患者進行RET(外顯子10～16)、VHL( 外顯子1～3)、 SDHD(外顯子1～4)、SDHB(外顯子1～8) 及SDHC(外顯子1～6) 基因測序。發(fā)現(xiàn)兩患者均有RET基因634號核酸發(fā)生突變，并對其家族其他成員的RET基因進行測序。結(jié)果其家族內(nèi)共有5例患者均有RET基因634號突變(TGC 突變?yōu)?CGC)，導致其氨基酸編碼由半胱氨酸變?yōu)榫彼帷Ｆ渲?例先為臨床診斷然后基因診斷，1例先由基因診斷然后臨床診斷，2例(均為兒童,分別為6歲及7歲)為基因診斷，目前尚未發(fā)病。其中3例行腹腔鏡雙側(cè)腎上腺腫瘤切除術，病理確診為雙側(cè)嗜鉻細胞瘤；1例行甲狀腺切除術，病理診斷為甲狀腺髓樣癌。結(jié)論對于多發(fā)性內(nèi)分泌多發(fā)腫瘤2A型患者及其家族成員行基因檢查不僅可以作為確診手段，更可以作為無癥狀者的預測診斷途徑。

家族性多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2A型；甲狀腺髓樣癌；RET基因；基因測序

筆者于2013-03-27和2013-04-11臨床發(fā)現(xiàn)2例雙側(cè)腎上腺嗜鉻細胞瘤患者，且兩人為親姐妹。通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)和DNA測序，分析了其家族中6個成員RET基因的11號外顯子突變情況，并進行了相應的臨床處置。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 病例1 女性(該家庭中的3號成員)，28歲，主因陣發(fā)性高血壓及檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)腎上腺占位入院。體檢：血壓120/80～200/100 mmHg。頸部可捫及包塊，質(zhì)硬。血清降鈣素正常。血清癌胚抗原32.75 ng/ml(正常值<5 ng/ml)，血漿總皮質(zhì)醇48.49 nmmol/L (240～618 nmol/L)。CT及MRI提示雙側(cè)腎上腺大小約6 cm×7 cm腫物。生長抑素受體顯像提示雙側(cè)腎上腺生長抑素受體高表達。甲狀腺超聲提示雙側(cè)甲狀腺腫物，左側(cè)1.5 cm×2.8 cm×1.8 cm，右側(cè)0.5 cm×0.5 cm×0.8 cm。2012-04-22于全麻下行腹腔鏡雙側(cè)腎上腺腫物切除術，病理提示雙側(cè)嗜鉻細胞瘤。術后血壓恢復正常。于2012-09-05于全麻下行雙側(cè)甲狀腺切除術，病理提示甲狀腺髓樣癌。

1.1.2 病例2 女性(該家庭中的4號成員)，29歲，主因陣發(fā)性高血壓半年，檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)腎上腺巨大腫物入院。尿去甲腎上腺素54.77 ng/24 h(正常值16.69～40.65 ng/24 h)，尿腎上腺素4.56 ng/24 h(1.74～6.42 ng/24 h)，尿多巴胺155.19 ng/24 h (120.93 ～330.59 ng/24 h)。影像學檢查，MRI提示雙側(cè)腎上腺占位,左側(cè)4 cm×3.5 cm×3 cm,右側(cè)6.5 cm×6 cm×5.5 cm。于2012-04-26于全麻下行雙側(cè)腹腔鏡腎上腺腫物切除術。病理提示嗜鉻細胞瘤。 術后血壓恢復正常。筆者對其家族成員進行基因測序并繪制家族系譜圖(圖1)。

1.2 基因測序方法 2013-06-08抽取2個原發(fā)患者的外周血(指南不推薦腫瘤基因測序)[1]測定RET(外顯子10 ～16)、VHL( 外顯子1～3)、SDHD(外顯子1～4)、SDHB(外顯子1～8) 及SDHC(外顯子1～6) 基因。通過PCR及毛細管電泳和熒光標記技術的DNA測序發(fā)現(xiàn)2個原發(fā)患者在RET基因634號位點有相同的突變，導致半胱氨酸變?yōu)榫彼?。之后測定其余家庭成員RET基因11號外顯子的序列。

圖1 MEN2A家庭系譜

1.2.1 反應引物 PCR放大RET、VHL、SDHD、 SDHB 及SDHC 。RET基因外顯子所用引物見表1。

表1 MEN2A患者RET基因PCR中的引物

1.2.2 實驗操作 (1)PCR擴增體系:包括GC buffer I 12.5 μl，dNTP(2.5 mmol)2 μl，上游引物(10 mmol)1 μl，下游引物(10 mmol)1 μl，DNA 2 μl，r Taq(Takara) 0.2 μl，水6.3 μl,總共25 μl。(2)PCR反應程序：DNA在DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)電泳后，于PTC-200 PCR儀(BIO-RAD)98℃變性5 min，55℃退火20 s，72℃延伸30 s。此循環(huán)共循環(huán)30次。(3)PCR產(chǎn)物純化：向96純化板(Millipore)孔中加入100 μl ddH2O，取出PCR產(chǎn)物至96純化板中室溫靜置10 min，真空抽濾泵抽(Millipore)10 min至抽干，向96孔純化板中加入40 μl ddH2O，室溫溶解10 min，取出對應的孔中的純化產(chǎn)物至另一96孔PCR板中。(4)PCR產(chǎn)物測序：測序體系包括DNA 3 μl(30～50 ng)，引物(3 pM)1 μl，Bigdye 0.5 μl，ddH2O 0.5 μl，總體積5 μl。 (5)PCR測序反應程序：95 ℃, 2 mins → (95℃ 10 s → 51 ℃ 10 s → 60 ℃190 s) × 25個循環(huán) → 12℃保溫，最后用UV-IV紫外分析儀(北京市新技術應用研究所)測出基因序列。

2 結(jié) 果

基因測序結(jié)果見圖2,家族中基因突變情況見表2。發(fā)現(xiàn)其家族內(nèi)有5個成員均有RET基因634號突變(TGC 突變?yōu)?CGC)，導致其氨基酸編碼由半胱氨酸變?yōu)榫彼?。其?例先臨床診斷然后基因診斷(即前述姐妹倆)；1例先是基因診斷然后臨床診斷(該家庭中的1號成員；該患者后在我院進行了手術，術后病理證實為雙側(cè)腎上腺嗜鉻細胞瘤)；2例(均為兒童,分別為6歲、7歲)為基因診斷，目前尚未發(fā)病。

表2 NEN2A家庭成員中RET基因突變情況

注：該家庭中的2號成員未到院檢測

圖2 RET基因634號位點突變(T→C)，突變處用黑點標記出

3 討 論

3.1 多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型臨床表現(xiàn) 多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型(multiple endocrine neoplasia 2, MEN2)可以分為三類：MEN 2A、家族型甲狀腺髓樣癌(familial medullary thyroid carcinoma，F(xiàn)MTC)和 MEN 2B。MEN 2A 臨床診斷需要在一個患者身上發(fā)現(xiàn)2個或2個以上特定的內(nèi)分泌腫瘤(甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細胞瘤或者甲狀旁腺腫瘤)。在MEN2A患者中有95%出現(xiàn)甲狀腺髓樣癌，50%出現(xiàn)嗜鉻細胞瘤，20%～30%出現(xiàn)甲狀旁腺功能亢進[2,3]。MNE2B比MEN2A更有侵略性，表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細胞瘤、馬方綜合征和黏膜腫瘤[4,5]。

3.2 RET基因遺傳學特點 RET基因位于10號染色體長臂11.2，編碼一種絡氨酸激酶受體[6]。此受體對神經(jīng)脊細胞、泌尿生殖系統(tǒng)、中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育起重要作用。RET基因突變是唯一已知導致MEN2型的基因。分子遺傳學檢測發(fā)現(xiàn)RET基因突變在MEN2A中占98%，在MEN2B中超過98%，在FMTC中占大約95%[7,8]。一些突變可以激活RET激酶活性，導致癌癥的發(fā)生。MEN2A的發(fā)生大多數(shù)由于RET基因細胞外區(qū)域氨基酸置換引起[9,10]。對于嗜鉻細胞瘤和非家族型嗜鉻細胞瘤可能存在可遺傳的RET、 VHL、 SDHD、 SDHB、 TMEM127、 MAX 及SDHA基因突變。

3.3 基因檢測的優(yōu)越性 MEN2是少數(shù)幾個需要進行基因檢測的疾病，MEN97研討會認為，在行甲狀腺切除術前需要進行RET基因突變檢測，而不是降鈣素刺激試驗[2]。理由如下：(1)早期發(fā)現(xiàn)和早期介入可以改變甲狀腺髓樣癌臨床進程。通過降鈣素刺激實驗篩查MTC患者并在其青少年期進行手術治療可以治愈大部分患者。(2) 早期MTC患者即使是大多數(shù)嬰兒也可以耐受甲狀腺切除術。(3)RET基因突變的研究表明，用降鈣素水平異常這一指標來決定是否進行甲狀腺切除術有5%～10%的假陽性率。(4)RET基因檢測相比降鈣素實驗而言有更高的確診率和更低的漏診率及假陽性。

大約98%的MEN2病例有明確的RET基因突變，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)與MEN2有關的RET基因突變主要集中在外顯子10、11、13、14、15和16。因此，這些外顯子需要優(yōu)先檢測是否存在突變。如果未發(fā)現(xiàn)突變，則需要檢測剩余的15個外顯子。可遺傳的嗜鉻細胞瘤包括MEN2A、MEN2B、 Von-Hippel-Lindau綜合征(VHL)、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤1型、副神經(jīng)節(jié)瘤和遺傳型嗜鉻細胞瘤。嗜鉻細胞瘤散發(fā)病例發(fā)病率5%～13%。在這些病例中進行RET、VHL及NF1基因檢測分析可能發(fā)現(xiàn)異常突變。

3.4 RET基因檢測的臨床意義 RET基因突變位點與MEN2疾病變化有對應關系，包括侵略性MTC。因此，在進行甲狀腺監(jiān)測時需要特別注意RET基因突變位點和其家庭成員特征性臨床表現(xiàn)。對于MTC的危險度需根據(jù)RET基因突變部位分層對待及處理。MEN2B或者有RET883、918或922密碼子基因突變的小孩，危險度為3級，需要在其6個月大時行甲狀腺切除術。在RET611、618、620或者634密碼子突變的小孩，危險度為2級，需在5歲前行甲狀腺切除術。在密碼子634突變的病例中，早期甲狀腺切除術已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2歲小孩的微小MTC病變及5歲小孩的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。一般來說，這些位點突變的病例MTC生長比較緩慢。一些學者建議在5歲時行甲狀腺切除術，另一些則建議10歲進行[11]。

通過基因測序，一些MEN2攜帶者在發(fā)展為MTC前就進行了甲狀腺切除術。但是，血清降鈣素及降鈣素刺激實驗仍然是術前及術后篩查及檢測腫瘤的理想指標。

嗜鉻細胞瘤已經(jīng)在除外RET基因609、768、val804met及891密碼子的其他所有突變中均有發(fā)現(xiàn)。在634密碼子突變中，最早可在5～10歲發(fā)現(xiàn)嗜鉻細胞瘤。對于更高危險度的突變，對于嗜鉻細胞瘤的檢測需在行甲狀腺切除術時或者5～7歲時，并且需要每年檢測一次。而對于RET基因609、768、val804met及891密碼子突變者，檢測可推遲一些。對于在634密碼子突變導致氨基酸改變，患者更傾向發(fā)展為甲狀旁腺功能亢進。突變在609、611、618、620、790及791密碼子的患者則較少地發(fā)展為甲狀旁腺功能亢進。血清甲狀旁腺激素及鈣水平需要每2～3年檢測一次[12]。

3.5 產(chǎn)前咨詢 由于基因檢測可以準確地檢測出是否患有MEN2疾病，因此對于MEN2致病基因攜帶者行產(chǎn)前咨詢是有必要的。對于MEN2A家族成員，RET基因測序可以做到早期診斷，并對其進行早期干預處理。

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(2014-02-12收稿 2014-04-20修回)

(責任編輯 梁秋野)

AChineseMEN2ApedigreeassociatedwithmutationofRETproto-oncogene

DING Wei1，2and ZHU Hongjian1，2. 1. Clinical Institute of Chinese People’s Armed Police General Hospital of Medical College，Anhui University，Beijing 100039，China； 2.Department of Urology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039，China

ObjectiveBy gene sequence ,biochemical and imaging testing, we introduce the diagnosis ,especially the predictive diagnosis of MEN2a.MethodsPeripheral blood from 2 patients who were sisters presenting pheochromocytoma as the first manifestation of disease was tested for mutations of RET(exon 10 ,11, 12,13,14,15,16), VHL( exon 1 to 3), SDHD(exon 1 to 4), SDHB(exon 1 to 8) and SDHC(exon 1 to 6) by means of genomic polymerase chain reaction (PCR) amplification and DNA sequencing. The mutation affected RET proto-oncogene codon 634 and caused a cysteine to arginine substitution. Then we sequenced the other family members’ RET gene exon 11.ResultsWe have detected point mutation in 5 MEN 2A patients in a MEN 2A family at codon 634 (TGC to CGC) in RET exon 11 which caused a cysteine to arginine substitution. Three of them were diagnosed as having bilateral adrenal pheochromocytomas by pathological examination and bilateral tumor in thyroid gland by ultrasound study. One patient underwent bilateral thyroidectomy and pathological examination showed medullary thyroid carcinoma.ConclusionsThe identification of a DNA alteration in the MEN2A gene will permit predictive diagnosis. Molecular testing of individuals at risk in these MEN 2A families is considered part of the standard management for at-risk family members.

multiple endocrine neoplasia type2; medullary thyroid carcinoma; RET gene；gene sequence

武警總醫(yī)院院級基金(WZ2012035)

丁 維，碩士研究生，E-mail:aydsummy@qq.com

1. 100039北京，安徽醫(yī)科大學武警總醫(yī)院臨床學院；2. 100039北京，武警總醫(yī)院泌尿外科

朱宏建，E-mail: hjzhu99@sina.com

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