閆紹悅等

摘 要：為驗證新藥清營口服液的安全性和有效性，進行了Wistar大鼠的安全性試驗和SPF雞臨床療效試驗。在40～10 g/kg b.w.劑量范圍內，經口給予清營口服液30 d后，檢查Wistar大鼠的一般生理狀態(tài)及血液生理、生化指標，并進行病理解剖及病理組織學檢查。結果表明清營口服液各劑量組所有檢測指標，與陰性對照組無顯著差異（P>0.05），且對Wistar大鼠的生長發(fā)育未產生影響，較長期重復應用無亞急性毒性，說明該藥安全性較強：通過對比清營口服液試驗組和氟苯尼考對照組對SPF雞的療效發(fā)現(xiàn)清營口服液組能夠對體內注射的大腸桿菌起到較好的抑菌和殺菌效果，從試驗雞的死亡率和分菌結果可以看出清營口服液總體預防和治療效果好于氟苯尼考，說明清營口服液有較好的臨床抗菌效果。

關鍵詞：清營口服液；大鼠；安全性試驗；大腸桿菌；抗菌效果

中圖分類號：S853.76 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0117-04

清營口服液是山東省農業(yè)科學院家禽研究所研制的新型中獸藥口服液，其處方主要來源于中醫(yī)清營涼血的著名經方清營湯，功效為清營解毒，透熱養(yǎng)陰，主治溫熱病邪傳入營分證。本實驗室通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)，清營口服液對治療雞大腸桿菌病具有切實療效。中醫(yī)藥是祖國醫(yī)學的瑰寶， 且被廣泛應用于臨床工作中，長期以來， 許多人認為中藥藥性緩和， 毒副作用小而安全， 中藥臨床應用的安全問題不夠重視。但近年關木通、龍膽瀉肝丸致急性腎衰竭[1]，雙黃連注射液、魚腥草注射液致過敏休克[2，3]等不良反應報道，使人們對中藥應用的安全性產生了懷疑。為了解新藥清營口服液在使用過程中的安全性，進行了Wistar大鼠相關安全性試驗，并采用SPF雞為實驗動物驗證其抗菌療效。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 健康Wistar大鼠80只，體重140～180 g，雌、雄各半，購自山東省實驗動物中心。7日齡SPF雞，平均體重105.5 g，購自山東昊泰特種動物繁育有限公司。

1.1.2 試驗菌株 大腸桿菌，編號09-29，血清型O24，山東省農業(yè)科學院家禽研究所保存。

1.1.3 試驗藥品和試劑 清營口服液，山東省農業(yè)科學院家禽研究所研制，由犀角、生地黃、玄參、黃連、金銀花、甘草等組成，委托煙臺綠葉動物保健品有限公司生產，批號為20120314，生藥含量2 000 mg/mL。氟苯尼考可溶性粉，山東昊泰科技藥業(yè)有限公司生產，批號20100925，含量為10%。哺乳動物血常規(guī)分析配套試劑，生化指標測定配套試劑，組織標本固定用試劑，普通固、液體培養(yǎng)基。

1.1.4 主要儀器 OLYMPUS Au2700全自動生化分析儀、Sysmex F-820型全自動血常規(guī)分析儀、生物顯微鏡、紫外分光光度計、離心機、組織切片機、超凈工作臺、振蕩搖床、恒溫培養(yǎng)箱、隔離器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 安全性試驗 ①清營口服液對大鼠自然狀況和體重的影響：本試驗受試藥物清營口服液對Wistar大鼠的經口最大耐受劑量（MTD）大于40 g/kg b.w.。因此本試驗將80只健康Wistar大鼠隨機分為高（40 g/kg b.w.）、中（20 g/kg b.w.）、低（10 g/kg b.w.）3個劑量組和1個陰性對照組，每組20只，雌雄各半。劑量組連續(xù)經口給藥30 d，陰性對照組給予相同量的無菌蒸餾水灌胃，每日給藥和灌胃時間一致。試驗期間，每天觀察記錄大鼠的一般行為表現(xiàn)、中毒及死亡情況，每7天測量記錄試驗大鼠體重、投入飼料量及剩余飼料量。

②血液生理、生化指標測定：試驗結束后各組取20只大鼠（雌、雄各半）采血樣，用全自動血液生理指標分析儀和自動血液生化指標分析儀分別測定血液生理和生化指標。血液生理指標包括：紅細胞數（RBC）、白細胞數（WBC）、血紅蛋白（HHb）、血小板數（PLT）、單核細胞數、嗜酸性粒細胞數。血液生化指標包括：谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、肌酐（CRE）、血糖（GLUC）、總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）等。

③病理學檢查：采血結束后，對各組大鼠（雌、雄各半）進行剖檢，觀察病變并做好記錄；剖檢大鼠的同時，稱量各主要臟器（包括肝、腎、脾、睪丸）重量，計算各臟器的相對重量（臟/體比值）；取高劑量組剖檢20只大鼠心、肝、脾、腎、胃腸、睪丸、卵巢和胸腺組織，石蠟包埋，切片，H-E染色，于普通光鏡下觀察有無病理變化，若發(fā)現(xiàn)病變再對較低劑量組大鼠的相應器官及組織進行檢查。

1.2.2 臨床藥效試驗 ①臨床試驗方法：將60只SPF雛雞，平均分成4組，每組15只，分別為清營口服液試驗組、氟苯尼考試驗組、單獨攻菌對照組、空白對照組。除空白對照組外，每組雞腹腔注射0.1 mL/只大腸桿菌菌液（用前培養(yǎng)至濃度為3×1010 cfu/mL）。清營口服液試驗組、氟苯尼考試驗組分別于攻菌前一天口服用藥兩次，每次0.2 mL；攻菌當天分別口服用藥3次，每次0.3 mL；攻菌后一天每組口服用藥兩次，每次0.3 mL。單獨攻菌組和空白對照組不用藥，但按照用藥組程序每次口服同劑量的生理鹽水。

②精神狀態(tài)、病理變化和分菌計數記錄：從服藥開始每組雞每隔8 h觀察記錄精神狀態(tài)和死亡情況，并于攻菌后48 h將存活雞處死，連同已死雞進行剖檢、分菌計數。剖檢過程中，完整摘取胸腺和脾臟稱重，計算每組雞免疫器官指數。免疫器官指數=免疫器官重量/體重×100。

③體溫測定和白細胞計數：四組試驗雞分別于攻菌前和攻菌后4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h測定體溫，并在攻菌前和攻菌后4、8、12、16、20、24、28、32、36 h采血進行白細胞計數。endprint

2 結果與分析

2.1 安全性試驗

2.1.1 清營口服液對大鼠自然狀況和體重的影響 經口給予大鼠清營口服液進行30天喂養(yǎng)試驗，在試驗過程中，觀察到各組大鼠的進食、飲水、精神狀態(tài)、活動狀況、被毛光澤度均無異常變化，體重均在正常范圍內增長。對表1中受試物各劑量組大鼠和陰性對照組大鼠體重進行t 檢驗，結果表明，在試驗結束后受試物各劑量組大鼠的體重與陰性對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.1.2 清營口服液對大鼠血液生理、生化指標的影響 大鼠血液生理指標的t檢驗結果（見表2）表明，受試物各劑量組大鼠的紅細胞數（RBC）、白細胞數（WBC）、血紅蛋白（HHb）、血小板數（PLT）、單核細胞數、嗜酸性粒細胞數與陰性對照組相比差異不顯著（P>0.05）。大鼠血液生化指標測定結果見表3，可以看出，受試物3個劑量組大鼠的血液生化指標與陰性對照組大鼠相應指標均在正常范圍內，且差異不顯著（P>0.05）。

2.1.3 大鼠的病理學檢查結果 剖檢結果顯示受試物3 個劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腎上腺、胃和腸與陰性對照組大鼠的各相應臟器比較無肉眼可見的病理變化；臟/體比值結果見表4。統(tǒng)計學分析顯示，清營口服液各劑量組的臟器系數與陰性對照組相比，差異不顯著（P>0.05）；組織切片結果顯示受試物各劑量組與陰性對照組所有剖檢大鼠心、肝、脾、腎、腸和胸腺組織未見任何明顯病理變化。

2.2 臨床藥效試驗結果

2.2.1 精神狀態(tài)、病理變化和分菌計數 從攻菌后8 h到試驗結束期間清營口服液組試驗雞的精神狀態(tài)（表5 ）好于氟苯尼考組和單獨攻菌組，死亡率明顯低于氟苯尼考組和單獨攻菌組。分菌結果（表5）顯示清營口服液組無菌雞只數明顯高于氟苯尼考組和單獨攻菌組。各組隨機取2只死雞剖檢可見胸腹氣囊炎、肝周炎、心包炎、脾臟腫大等病理變化。免疫器官指數結果（見表6）顯示清營口服液組胸腺指數顯著低于其它三組 （P<0.05），而脾臟指數顯著高于其它三組（P<0.05）。

2.2.2 體溫測定和白細胞計數 體溫測定結果（表7）顯示，清營口服液組試驗雞在攻菌后16～28 h體溫一直處于較高階段，與其它三組比較，體溫差別變化不大。白細胞計數結果（表8）顯示清營口服液組白細胞數與空白對照組變化不大。

3 結論與討論

通過連續(xù)給藥30 d，清營口服液各劑量組動物生長發(fā)育良好，體重、臟器系數、血常規(guī)和血液生化指標等各項指標與對照組之間均無統(tǒng)計學差異，且均在正常范圍。其中母鼠的體重、增重、耗料及飼料利用率較公鼠的少，可解釋為性別差異所造成。綜上所述，在本試驗條件下，未發(fā)現(xiàn)清營口服液對Wistar大鼠的生長發(fā)育產生影響，長期重復應用無亞急性毒性，清營口服液的安全性較好。

通過與氟苯尼考試驗組比對，發(fā)現(xiàn)清營口服液組預防和治療效果好于氟苯尼考組。其作用機理不僅僅是直接對細菌的殺滅作用，通過攻菌后試驗雞的白細胞計數和脾臟免疫器官指數明顯高于氟苯尼考試驗組和單獨攻菌組和空白對照組可推知，清營口服液應該在體內提高機體免疫應答水平，促進免疫器官發(fā)育和體液免疫。但本試驗體溫組間變化不大，清營口服液組試驗雞在攻菌后16～28 h體溫一直處于較高階段，而且該階段該試驗組雞白細胞數變化不明顯，但死亡率有所提高，可能原因為此時間段大腸桿菌在體內繁殖達到頂峰而中藥作用還沒有達到最佳療效，說明中藥治療起效有一個時間段，需要在體內有一個二次代謝或者激發(fā)免疫應答過程，該藥的使用能將提前預防和治療結合起來才是最佳用藥方式。另外清營口服液組胸腺指數明顯低于其他組，剖檢發(fā)現(xiàn)其胸腺大都萎縮，由此推斷可能是該藥主要激發(fā)機體的體液免疫而對細胞免疫刺激作用不強導致，具體原因還需進一步試驗印證?？傮w而言，上述試驗證實，清營口服液具有較好的安全性和臨床藥效，適合作為治療由大腸桿菌相關病因導致的家禽熱證的藥物。

參 考 文 獻：

[1] 李鋒， 程慶礫， 董柯，等. 對13例木通中毒導致急性腎功能衰竭的分析[J].中國中藥雜志，1999，24（7）：435-437.

[2] 呂福云，冀潤利，王淑華.雙黃連注射液致過敏性休克 2 例 [J].天津醫(yī)藥，2005，33（3）：163-165.

[3] 曾聰彥，梅全喜. 魚腥草注射液致過敏性休克62例文獻分析[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析，2008，8（11）：865-867.endprint

2 結果與分析

2.1 安全性試驗

2.1.1 清營口服液對大鼠自然狀況和體重的影響 經口給予大鼠清營口服液進行30天喂養(yǎng)試驗，在試驗過程中，觀察到各組大鼠的進食、飲水、精神狀態(tài)、活動狀況、被毛光澤度均無異常變化，體重均在正常范圍內增長。對表1中受試物各劑量組大鼠和陰性對照組大鼠體重進行t 檢驗，結果表明，在試驗結束后受試物各劑量組大鼠的體重與陰性對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.1.2 清營口服液對大鼠血液生理、生化指標的影響 大鼠血液生理指標的t檢驗結果（見表2）表明，受試物各劑量組大鼠的紅細胞數（RBC）、白細胞數（WBC）、血紅蛋白（HHb）、血小板數（PLT）、單核細胞數、嗜酸性粒細胞數與陰性對照組相比差異不顯著（P>0.05）。大鼠血液生化指標測定結果見表3，可以看出，受試物3個劑量組大鼠的血液生化指標與陰性對照組大鼠相應指標均在正常范圍內，且差異不顯著（P>0.05）。

2.1.3 大鼠的病理學檢查結果 剖檢結果顯示受試物3 個劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腎上腺、胃和腸與陰性對照組大鼠的各相應臟器比較無肉眼可見的病理變化；臟/體比值結果見表4。統(tǒng)計學分析顯示，清營口服液各劑量組的臟器系數與陰性對照組相比，差異不顯著（P>0.05）；組織切片結果顯示受試物各劑量組與陰性對照組所有剖檢大鼠心、肝、脾、腎、腸和胸腺組織未見任何明顯病理變化。

2.2 臨床藥效試驗結果

2.2.1 精神狀態(tài)、病理變化和分菌計數 從攻菌后8 h到試驗結束期間清營口服液組試驗雞的精神狀態(tài)（表5 ）好于氟苯尼考組和單獨攻菌組，死亡率明顯低于氟苯尼考組和單獨攻菌組。分菌結果（表5）顯示清營口服液組無菌雞只數明顯高于氟苯尼考組和單獨攻菌組。各組隨機取2只死雞剖檢可見胸腹氣囊炎、肝周炎、心包炎、脾臟腫大等病理變化。免疫器官指數結果（見表6）顯示清營口服液組胸腺指數顯著低于其它三組 （P<0.05），而脾臟指數顯著高于其它三組（P<0.05）。

2.2.2 體溫測定和白細胞計數 體溫測定結果（表7）顯示，清營口服液組試驗雞在攻菌后16～28 h體溫一直處于較高階段，與其它三組比較，體溫差別變化不大。白細胞計數結果（表8）顯示清營口服液組白細胞數與空白對照組變化不大。

3 結論與討論

通過連續(xù)給藥30 d，清營口服液各劑量組動物生長發(fā)育良好，體重、臟器系數、血常規(guī)和血液生化指標等各項指標與對照組之間均無統(tǒng)計學差異，且均在正常范圍。其中母鼠的體重、增重、耗料及飼料利用率較公鼠的少，可解釋為性別差異所造成。綜上所述，在本試驗條件下，未發(fā)現(xiàn)清營口服液對Wistar大鼠的生長發(fā)育產生影響，長期重復應用無亞急性毒性，清營口服液的安全性較好。

通過與氟苯尼考試驗組比對，發(fā)現(xiàn)清營口服液組預防和治療效果好于氟苯尼考組。其作用機理不僅僅是直接對細菌的殺滅作用，通過攻菌后試驗雞的白細胞計數和脾臟免疫器官指數明顯高于氟苯尼考試驗組和單獨攻菌組和空白對照組可推知，清營口服液應該在體內提高機體免疫應答水平，促進免疫器官發(fā)育和體液免疫。但本試驗體溫組間變化不大，清營口服液組試驗雞在攻菌后16～28 h體溫一直處于較高階段，而且該階段該試驗組雞白細胞數變化不明顯，但死亡率有所提高，可能原因為此時間段大腸桿菌在體內繁殖達到頂峰而中藥作用還沒有達到最佳療效，說明中藥治療起效有一個時間段，需要在體內有一個二次代謝或者激發(fā)免疫應答過程，該藥的使用能將提前預防和治療結合起來才是最佳用藥方式。另外清營口服液組胸腺指數明顯低于其他組，剖檢發(fā)現(xiàn)其胸腺大都萎縮，由此推斷可能是該藥主要激發(fā)機體的體液免疫而對細胞免疫刺激作用不強導致，具體原因還需進一步試驗印證。總體而言，上述試驗證實，清營口服液具有較好的安全性和臨床藥效，適合作為治療由大腸桿菌相關病因導致的家禽熱證的藥物。

參 考 文 獻：

[1] 李鋒， 程慶礫， 董柯，等. 對13例木通中毒導致急性腎功能衰竭的分析[J].中國中藥雜志，1999，24（7）：435-437.

[2] 呂福云，冀潤利，王淑華.雙黃連注射液致過敏性休克 2 例 [J].天津醫(yī)藥，2005，33（3）：163-165.

[3] 曾聰彥，梅全喜. 魚腥草注射液致過敏性休克62例文獻分析[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析，2008，8（11）：865-867.endprint

2 結果與分析

2.1 安全性試驗

2.1.1 清營口服液對大鼠自然狀況和體重的影響 經口給予大鼠清營口服液進行30天喂養(yǎng)試驗，在試驗過程中，觀察到各組大鼠的進食、飲水、精神狀態(tài)、活動狀況、被毛光澤度均無異常變化，體重均在正常范圍內增長。對表1中受試物各劑量組大鼠和陰性對照組大鼠體重進行t 檢驗，結果表明，在試驗結束后受試物各劑量組大鼠的體重與陰性對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.1.2 清營口服液對大鼠血液生理、生化指標的影響 大鼠血液生理指標的t檢驗結果（見表2）表明，受試物各劑量組大鼠的紅細胞數（RBC）、白細胞數（WBC）、血紅蛋白（HHb）、血小板數（PLT）、單核細胞數、嗜酸性粒細胞數與陰性對照組相比差異不顯著（P>0.05）。大鼠血液生化指標測定結果見表3，可以看出，受試物3個劑量組大鼠的血液生化指標與陰性對照組大鼠相應指標均在正常范圍內，且差異不顯著（P>0.05）。

2.1.3 大鼠的病理學檢查結果 剖檢結果顯示受試物3 個劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腎上腺、胃和腸與陰性對照組大鼠的各相應臟器比較無肉眼可見的病理變化；臟/體比值結果見表4。統(tǒng)計學分析顯示，清營口服液各劑量組的臟器系數與陰性對照組相比，差異不顯著（P>0.05）；組織切片結果顯示受試物各劑量組與陰性對照組所有剖檢大鼠心、肝、脾、腎、腸和胸腺組織未見任何明顯病理變化。

2.2 臨床藥效試驗結果

2.2.1 精神狀態(tài)、病理變化和分菌計數 從攻菌后8 h到試驗結束期間清營口服液組試驗雞的精神狀態(tài)（表5 ）好于氟苯尼考組和單獨攻菌組，死亡率明顯低于氟苯尼考組和單獨攻菌組。分菌結果（表5）顯示清營口服液組無菌雞只數明顯高于氟苯尼考組和單獨攻菌組。各組隨機取2只死雞剖檢可見胸腹氣囊炎、肝周炎、心包炎、脾臟腫大等病理變化。免疫器官指數結果（見表6）顯示清營口服液組胸腺指數顯著低于其它三組 （P<0.05），而脾臟指數顯著高于其它三組（P<0.05）。

2.2.2 體溫測定和白細胞計數 體溫測定結果（表7）顯示，清營口服液組試驗雞在攻菌后16～28 h體溫一直處于較高階段，與其它三組比較，體溫差別變化不大。白細胞計數結果（表8）顯示清營口服液組白細胞數與空白對照組變化不大。

3 結論與討論

通過連續(xù)給藥30 d，清營口服液各劑量組動物生長發(fā)育良好，體重、臟器系數、血常規(guī)和血液生化指標等各項指標與對照組之間均無統(tǒng)計學差異，且均在正常范圍。其中母鼠的體重、增重、耗料及飼料利用率較公鼠的少，可解釋為性別差異所造成。綜上所述，在本試驗條件下，未發(fā)現(xiàn)清營口服液對Wistar大鼠的生長發(fā)育產生影響，長期重復應用無亞急性毒性，清營口服液的安全性較好。

通過與氟苯尼考試驗組比對，發(fā)現(xiàn)清營口服液組預防和治療效果好于氟苯尼考組。其作用機理不僅僅是直接對細菌的殺滅作用，通過攻菌后試驗雞的白細胞計數和脾臟免疫器官指數明顯高于氟苯尼考試驗組和單獨攻菌組和空白對照組可推知，清營口服液應該在體內提高機體免疫應答水平，促進免疫器官發(fā)育和體液免疫。但本試驗體溫組間變化不大，清營口服液組試驗雞在攻菌后16～28 h體溫一直處于較高階段，而且該階段該試驗組雞白細胞數變化不明顯，但死亡率有所提高，可能原因為此時間段大腸桿菌在體內繁殖達到頂峰而中藥作用還沒有達到最佳療效，說明中藥治療起效有一個時間段，需要在體內有一個二次代謝或者激發(fā)免疫應答過程，該藥的使用能將提前預防和治療結合起來才是最佳用藥方式。另外清營口服液組胸腺指數明顯低于其他組，剖檢發(fā)現(xiàn)其胸腺大都萎縮，由此推斷可能是該藥主要激發(fā)機體的體液免疫而對細胞免疫刺激作用不強導致，具體原因還需進一步試驗印證。總體而言，上述試驗證實，清營口服液具有較好的安全性和臨床藥效，適合作為治療由大腸桿菌相關病因導致的家禽熱證的藥物。

參 考 文 獻：

[1] 李鋒， 程慶礫， 董柯，等. 對13例木通中毒導致急性腎功能衰竭的分析[J].中國中藥雜志，1999，24（7）：435-437.

[2] 呂福云，冀潤利，王淑華.雙黃連注射液致過敏性休克 2 例 [J].天津醫(yī)藥，2005，33（3）：163-165.

[3] 曾聰彥，梅全喜. 魚腥草注射液致過敏性休克62例文獻分析[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析，2008，8（11）：865-867.endprint