伊世芹，李彥珊，苗麗霞，孫巖峰，王 軍，劉紅艷，楊新吉，劉秋玲

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤小鼠模型的建立

伊世芹1，李彥珊2，苗麗霞2，孫巖峰2，王 軍2，劉紅艷2，楊新吉2，劉秋玲2

目的 建立視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)模型，為研究RB新療法提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。方法 選取出生第1天的CD1小鼠40只，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組10只。設(shè)每組小鼠的右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為對(duì)照眼，將RB-Y79細(xì)胞以4 μl/只注射至右眼玻璃體腔內(nèi)，A、B、C、D組注射的RB-Y79濃度分別是2.0×107/ml、3.0×107/ml、3.5×107/ml、4.0×107/ml。4組小鼠左眼均注射等量重懸細(xì)胞的溶劑；觀察小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)及移植瘤生長(zhǎng)情況，并與對(duì)照眼比較，選擇出最佳建模細(xì)胞濃度；取出的組織常規(guī)石蠟切片HE染色，觀察移植瘤組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果 注射RB-Y79細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)小鼠右眼可形成腫瘤，而對(duì)照眼左眼無腫瘤形成；注射的RB-Y79細(xì)胞濃度不同，成瘤率和存活率不同，第10天A、B、C、D組的成瘤率分別為20%、80%、100%和100%，存活率分別為100%、80%、80%和50%。C組3.5×107/ml為最佳建模濃度；移植瘤組織病理檢查：右眼眼球結(jié)構(gòu)被破壞。瘤細(xì)胞大小不等，形態(tài)為圓形、橢圓形、多邊形或不規(guī)則形；細(xì)胞質(zhì)少；胞核大，圓形，卵圓形或不規(guī)則形，染色深，有1～2個(gè)以上核樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論 新生小鼠玻璃體腔內(nèi)注射RB-Y79細(xì)胞可成功建立RB小鼠模型。

CD1新生小鼠；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；移植瘤模型

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是嬰幼兒最常見眼內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤[1]，致殘率、病死率高。我國(guó)每年新增RB病例約占全球新增病例的20%[2，3]。發(fā)達(dá)國(guó)家RB患兒的5年生存率已達(dá)90%以上[4]，但在我國(guó)RB患兒的病死率仍很高。因此，探索新的治療方法成為我國(guó)RB治療的重要研究方向。由于各種新的治療手段在進(jìn)入臨床應(yīng)用之前，必須先經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，為此，本研究選用出生第1天的新生小鼠，進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)注射RB-Y9細(xì)胞，成功建立了RB移植瘤小鼠模型，為研究RB新的治療方法和新的藥物提供合適的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 人RB-Y79細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；新生CD1小鼠，飼養(yǎng)于北京生命科學(xué)研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 方法

1.2.1 準(zhǔn)備受孕母鼠 15只CD1成年母鼠，每盒3只置于5個(gè)鼠盒中，分別放入1只CD1成年雄鼠。每天早晚檢查1次母鼠陰道，觀察有無孕栓形成。將查到孕栓的母鼠從雌雄同盒中取出，單獨(dú)放于其他鼠盒，標(biāo)記受孕日期。

1.2.2 受孕母鼠待產(chǎn)準(zhǔn)備 根據(jù)受孕期，推算出小鼠出生日期(一般小鼠的孕期為18.5～19.5 d)。在查出孕栓后17.5 d時(shí)，將腹部膨隆的母鼠單獨(dú)放于鼠盒中，1個(gè)鼠盒放1只孕鼠，標(biāo)記受孕日期，待產(chǎn)。

1.2.3 選取建模用新生CD1小鼠并進(jìn)行分組 為保證實(shí)驗(yàn)的可比性，選取同一天出生的小鼠進(jìn)行建模，在本研究的15只母鼠中，同一天受孕最多的是5只，共產(chǎn)小鼠54只，死亡0只。在存活的54只出生第1天的新生小鼠中選取40只，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組10只，選擇每只小鼠的右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為對(duì)照眼。

1.2.4 復(fù)蘇、培養(yǎng)RBY-79細(xì)胞 小鼠出生前2 d復(fù)蘇RBY-79細(xì)胞并傳代，使之生長(zhǎng)狀態(tài)良好。待RBY-79細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)、離心、重懸，然后接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈雙抗、15 mmol/L HEPES的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、相對(duì)濕度95%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液顏色由紅色變?yōu)辄S色時(shí)更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞80%融合后即可按1∶3到1∶6傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用0.05%胰酶-EDTA混合消化液消化，計(jì)數(shù)、離心，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度分別為2.0×107/ml、3.0×107/ml、3.5×107/ml、4.0×107/ml，備用。

1.2.5 注射RB-Y9細(xì)胞建模 固定實(shí)驗(yàn)小鼠于體式顯微鏡下，找到小鼠眼裂的體表痕跡，用5 μl微量注射器，抽取事先調(diào)整好濃度的RBY-79細(xì)胞懸液，于眼裂體表痕跡下1～2 mm處進(jìn)針，進(jìn)針2～3 mm，有針尖刺破小鼠皮膚的落空感時(shí)，即將細(xì)胞懸液緩慢推注到小鼠玻璃體腔，每只小鼠注射4 μl，注射后退針。A、B、C、D組小鼠注射的細(xì)胞濃度依次為2.0×107/ml、3.0×107/ml 、3.5×107/ml、4.0×107/ml。以同樣方法，向作為對(duì)照眼的每只實(shí)驗(yàn)小鼠的左眼，注射4 μl上述細(xì)胞重懸用溶劑。

1.2.6 觀察成瘤情況 注射腫瘤細(xì)胞后，每天觀察各組小鼠生活狀態(tài)變化。于體式顯微鏡下觀察小鼠右眼移植瘤生長(zhǎng)情況，并與左眼對(duì)照，拍照、記錄觀察結(jié)果。標(biāo)記可見腫瘤形成小鼠，不同時(shí)間可見腫瘤團(tuán)塊的小鼠剪掉不同的腳趾 ，以區(qū)別于未見腫瘤形成的小鼠。如遇小鼠死亡，即解剖死亡小鼠，剪開其眼瞼，觀察是否有腫瘤形成，計(jì)算小鼠成瘤率。

1.2.7 切除小鼠移植瘤 準(zhǔn)備好小鼠解剖剪刀、鑷子，1XPBS、4% PFA，將小鼠取出鼠盒，用CO2安樂處死。置于體式顯微鏡下，用解剖鑷夾起小鼠眼瞼，沿著腫瘤邊緣將眼瞼剪開，用鑷子輕輕將小鼠的眼瞼扯下，若眼瞼和腫瘤粘連較緊密，撕扯會(huì)損壞腫瘤的完整性，此時(shí)可用解剖剪刀沿著眼瞼與腫瘤粘連的邊緣將眼瞼剪下，以保證腫瘤組織的完整性。若出血較多，即用1XPBS沖洗，清楚視野。將完整解剖出來的腫瘤組織用4% PFA固定。以同樣的方法解剖每只小鼠的左眼，同樣將解剖出來的左眼眼球用4%PFA固定。

1.2.8 確認(rèn)移植瘤病理形態(tài) 觀察切除腫瘤的顏色、質(zhì)地并記錄。將上述腫瘤組織及切除的左眼眼球分別做石蠟切片，切片厚5 μm。進(jìn)行HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)，明確腫瘤組織的病理學(xué)類型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組樣本間率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同RB細(xì)胞濃度小鼠的成瘤率及存活率 注射腫瘤細(xì)胞10 d后，C組和D組成瘤率最高，均為100%，存活率分別為80%和50%，兩組存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。因此，C組細(xì)胞濃度3.5×107/ml, 4 μl/只是建模最佳濃度，成瘤率、存活率最高。

2.2 注射RB-Y79細(xì)胞(3.5×107/ml)的CD1小鼠移植瘤形成情況 見圖1。注射腫瘤細(xì)胞后連續(xù)2 d未見腫瘤形成，第3天可見7只小鼠右眼球較左眼球突出皮膚表面。第4天，之前未見腫瘤團(tuán)塊形成的3只小鼠右眼見腫瘤團(tuán)塊的形成，之前有腫瘤形成的小鼠右眼球更明顯的突出于皮膚表面；第7天，1小鼠自發(fā)死亡，解剖該小鼠，剪開眼瞼，右眼可見明顯的腫瘤組織的形成，左眼未見異常；第10天，剩余8只存活小鼠，腫瘤更加突出增大。

表1 4組不同濃度細(xì)胞培養(yǎng)下視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤小鼠的10 d成瘤率及存活率

注：A、B、C、D組分別表示Y79濃度是2.0×107/ml、3.0×107/ml、3.5×107/ml、4.0×107/ml；與A組比較，①P<0.05；與C組比較，②P<0.05

2.3 移植瘤組織病理形態(tài) 對(duì)照的左眼HE染色，可以見到清晰完整的眼球基本結(jié)構(gòu)；右眼眼球結(jié)構(gòu)破壞，被腫瘤細(xì)胞占據(jù)；腫瘤細(xì)胞大小不等，呈圓形、橢圓形、多邊形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)少，胞核大，染色深，有1～2個(gè)核樣結(jié)構(gòu)體(圖2)。

圖1 注射RB-Y79(3.5×107/ml)細(xì)胞后CD1移植瘤形成過程

A. 第3天，右眼(箭頭所指，后同)；B. 第3天，左眼；C. 第5天，右眼；D. 第5天，左眼；E. 第7天，剖開眼瞼小鼠右眼；F. 第7天，剖開眼瞼小鼠左眼；G. 第10天，移植瘤更加增大，明顯突出于皮膚表面；H.第10天，剪開小鼠右眼眼瞼，腫瘤組織呈魚肉狀，腫瘤表面可見豐富的血管網(wǎng)，腫瘤中心部位呈向內(nèi)凹陷現(xiàn)象，并可見輕微出血壞死(箭頭所示)；I. 完整解剖出來的腫瘤(箭頭所示)，部分移植瘤呈紅色，有明顯充血現(xiàn)象，部分移植瘤呈瓷白色，無明顯充血，部分移植瘤表面光滑，部分移植瘤形態(tài)很不規(guī)則。左眼眼球形狀規(guī)則，呈圓形，眼球透光度好，玻璃體內(nèi)晶狀體清晰可見

圖2 注射RB-Y79(3.5×107/ml)細(xì)胞后小鼠第10天病理(HE)

3 討 論

移植性腫瘤動(dòng)物模型是篩選抗腫瘤新藥中最常用的模型。1969年，丹麥Rygaard和Povsen[5]首先將人類結(jié)腸腺癌移植到裸小鼠成功，為移植性腫瘤動(dòng)物模型開創(chuàng)了新局面。裸鼠由于先天缺乏T細(xì)胞免疫，缺少了對(duì)異種物質(zhì)的排斥反應(yīng)，這一特點(diǎn)為人源腫瘤細(xì)胞找到一個(gè)合適的活載體，所以很多對(duì)人源腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移研究都借助于裸鼠。1977年，Gallie等[6]首先報(bào)道將新鮮RB手術(shù)切除標(biāo)本制成細(xì)胞懸液后接種于裸小鼠眼前房?jī)?nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤標(biāo)本能生長(zhǎng)增殖，且能成功傳代。1995年，易先金等[7]成功建立了一株人RB裸小鼠移植瘤，共接種5例新鮮RB手術(shù)標(biāo)本于裸小鼠皮下，結(jié)果僅1例獲得成功。2009年，孫瑩等[8]于成年裸鼠身上建立視網(wǎng)膜移植瘤模型獲得成功。與腫瘤相關(guān)的研究離不開免疫，由于缺少了T細(xì)胞免疫，裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和人體內(nèi)的情況會(huì)有很大差異，對(duì)于裸鼠接種的腫瘤，瘤體可以長(zhǎng)到接近裸鼠自身體重的程度，而裸鼠仍然可以存活很長(zhǎng)時(shí)間，但是如果發(fā)生在人體，機(jī)體將難以承受。此外，很多基因、蛋白和藥物對(duì)于腫瘤的作用均是通過作用于免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用，而沒有T細(xì)胞免疫的裸鼠本身成為這方面研究的最大障礙，裸鼠的優(yōu)點(diǎn)也成為了其缺點(diǎn)，且裸小鼠抵抗力差，飼養(yǎng)和繁殖要求條件比較嚴(yán)格，易患病毒性肝炎和肺炎， 受孕率低。由于以上種種原因，裸鼠建立腫瘤動(dòng)物模型有很多局限性。

目前，國(guó)際上用于RB研究的動(dòng)物模型主要采用反轉(zhuǎn)錄病毒法小鼠視網(wǎng)膜單個(gè)前體細(xì)胞內(nèi)癌基因?qū)氲霓D(zhuǎn)基因RB小鼠模型，或者采用基因敲除的方法，將小鼠RB及P53或P107基因一起敲除[9-12]。這些模型的優(yōu)點(diǎn)是更接近于人類RB的形成，但是，此模型的獲得周期長(zhǎng)，數(shù)量受限，且價(jià)格昂貴，不適合臨床前期藥物選擇。

本研究采用RB-Y79細(xì)胞在新出生的無免疫缺陷CD1小鼠玻璃體腔建立視網(wǎng)膜移植瘤模型。借鑒于RB在成年裸鼠建立移植瘤所需的細(xì)胞數(shù)[6-8]，本研究設(shè)置了4組不同的細(xì)胞濃度在新生CD1小鼠玻璃體內(nèi)建立移植瘤模型。根據(jù)新生小鼠眼球的解剖結(jié)構(gòu)，我們確定了注射腫瘤細(xì)胞到玻璃體腔內(nèi)的進(jìn)針位置及深度，在注射器的針尖穿透眼瞼進(jìn)入玻璃體腔時(shí)，會(huì)有一個(gè)輕微的落空感，若不慎將腫瘤細(xì)胞注入了眼眶，沒有進(jìn)入玻璃體腔，在把針尖拔出后，細(xì)胞懸液隨即會(huì)從針孔溢出，表示注射失敗。

RB-Y79細(xì)胞系來源于一有母系家族史的2歲半白種女性RB患兒，是第1個(gè)培養(yǎng)成功的人類RB細(xì)胞株，目前在國(guó)際上應(yīng)用較為廣泛[13]。新生24 h內(nèi)的小鼠免疫系統(tǒng)尚未完善[14]，排斥反應(yīng)小，適于腫瘤種植。CD1小鼠是沒有基因缺陷的正常小鼠；小鼠的產(chǎn)仔數(shù)量多，適于實(shí)驗(yàn)要求；相對(duì)于其他品系的小鼠CD1小鼠哺乳期的母鼠不會(huì)把非親生的小鼠吃掉，更適合做代孕媽媽。RB主要發(fā)生于3歲之內(nèi)的嬰幼兒，選用無免疫缺陷的新生小鼠建立腫瘤模型，其生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境比成年鼠更接近腫瘤在人體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。新生小鼠移植瘤模型的建立，可彌補(bǔ)裸鼠腫瘤模型的不足，更好地促進(jìn)腫瘤研究的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RB-Y79細(xì)胞在新生CD1小鼠玻璃體腔內(nèi)可成功種植。最佳建模濃度是3.5×107/ml，4 μl/只，本實(shí)驗(yàn)濃度梯度中該濃度成瘤率最高的同時(shí)存活率最高，接種腫瘤細(xì)胞后第3天即可見腫瘤團(tuán)塊的形成，第10天成瘤率100%。HE染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞在玻璃體內(nèi)聚集成瘤，眼球結(jié)構(gòu)被破壞，腫瘤生長(zhǎng)速度較快，明顯突出于眶外。移植瘤腫瘤細(xì)胞大小不等，呈圓形、橢圓形、多邊形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)少，胞核大，染色深，有1～2個(gè)以上核樣結(jié)構(gòu)體，組織細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)與人類RB相符合。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過玻璃體腔RB-Y79細(xì)胞接種可以建立新生小鼠RB模型，為RB治療研究提供了更佳的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

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(2014-05-20收稿 2014-08-15修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Development of a new retinoblastoma mouse model

YI Shiqin1, LI Yanshan2, MIAO Lixia2, SUN Yanfeng2, WANG Jun2, LIU Hongyan2, YANG Xinji2, and LIU Qiuling2.

1. Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China; 2. Department of Pediatrics, The General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To establish a retinoblastoma model and provide an animal model for the new treatment of RB. Methods Forty CD1 postnatal day 1 mice were randomly divided into 4 groups ( A,B, C, D), 10 in each. We set the right eye of each mouse as experiment group and the left as control. Different density of RB-Y9 cells(A 2.0×107/ml，B 3.0×107/ml，C 3.5×107/ml，D 4.0×107/ml, 4 μl/one) were injected into the vitreous cavity of right eyes, and the left eyes were injected with the same volume of cell culture medium. We closely monitored the tumor growth after injection and found the most appropriate density of the cells for the model construction. We used HE staining to analyze the tumor formation and histology and convinced that the tumor was RB. Results After the cell injection, we found no tumor formation in control group and most mice in the experiment group had tumors. Different density of injeced cells resulted in different rates of survival and tumor formation: the rate of tumor formation in the above 4 groups were 20%,80%,100% and 100% and the survival rates were100%,80%,80% and 50%. We regarded the C group (the density of the cells was 3.5×107/ml) as the best model for the experiment. HE staining of the tumor tissues implied that the structure of right eyes were severely destroyed and the cells had different size and were irregularly shaped: some were circular, oval and others were polygonal or irregular. The tumor cells had less cytoplasm and bigger nuclei when compared with normal controls. Cells with more than 1-2 nuclei can be frequently observed. Conclusions By injecting RB-Y79 cells in the vitreous cavity of neonatal mice can successfully develop the RB mouse model.

CD1 postnatal day 1mice; retinoblastoma; transplanted tumor model

伊世芹，碩士，醫(yī)師，E-mail: yishiqin2006@163.com

1. 221002，徐州醫(yī)學(xué)院;2.100039北京，武警總醫(yī)院兒科

劉秋玲，E-mail:wj670@vip.sina.com

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