張麗華

(山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009)

氯過氧化物酶(Chloroperoxidase，CPO)是一種具有多種催化活性和廣泛底物適應(yīng)性的血紅素過氧化物酶，目前被認為是過氧化物酶家族中應(yīng)用最廣泛的酶之一。它是用H2O2等過氧化物(ROOH)作電子受體，催化各類底物發(fā)生氧化反應(yīng)的酶。1961年，Hager等[1-2]首次從海洋真菌(Calderiomyces fuma?go)培養(yǎng)液中分離檢測出CPO。其相對分子質(zhì)量約為42000 Da，等電點(pI)在 3.2 ～ 4.0 之間[3]。由于CPO獨特的活性位點結(jié)構(gòu)，可催化多種反應(yīng)，如鹵化、過氧化、氧插入反應(yīng)，以及將過氧化氫分解為氧和水。另外，CPO具有高的立體選擇性，能催化烯烴發(fā)生環(huán)氧化。CPO被廣泛應(yīng)用于手性化合物的合成、石油凈化、染料降解和電化學(xué)應(yīng)用等領(lǐng)域，對于氯過氧化物酶的研究具有重要意義。

1 CPO的結(jié)構(gòu)

CPO的晶體結(jié)構(gòu)如圖1，不同顏色表示其次級結(jié)構(gòu)的一些關(guān)鍵元素，紫色表示錳緊挨著中心血紅素。CPO含有一條單一的多肽鏈，這條多肽鏈由299個氨基酸組成且折疊成8個螺旋狀。由于遠端血紅素中近端配體半胱氨基酸和過氧化氫有結(jié)合點，導(dǎo)致CPO與細胞色素P-450的分子結(jié)構(gòu)有一定相似度；但由于CPO獨特的活性位點結(jié)構(gòu)，使它與其他的血紅素過氧化物酶和細胞色素P-450有著本質(zhì)的差別，從而顯示出CPO的催化多樣性。CPO分子中血紅素的“遠端”是以谷氨酸(Glu183)而非組氨酸來起催化作用的，同時在形成化合物Cpd I的過程中，還起到斷開O-O鍵的作用[4-5]。CPO分子中的血紅素上還包含一個疏水基團，此疏水基團增強了其與底物的結(jié)合能力。

1995年，Sundaramoorthy[4]首次公開CPO的晶體結(jié)構(gòu)圖。研究顯示，CPO活性位點的輔基是一個高自旋原卟啉IX分子。鐵原子和吡咯環(huán)的4個N原子進行5配位，半胱氨基酸(Cys29)殘基的硫原子代替組氨酸的咪唑基作為亞鐵血紅素的第5軸向配體。整個血紅素是夾在C-末端和N-末端螺旋的表面間。完整的CPO結(jié)構(gòu)是由8個α-螺旋結(jié)構(gòu)組成的，命名為A～H。CPO的遠端殘基位于F螺旋中；CPO的近端位于A螺旋垂直于血紅素平面且緊挨著N-末端，這是CPO區(qū)別于其他過氧化物酶和細胞色素P-450的關(guān)鍵點。目前，我們?nèi)匀徊磺宄绊慍PO性質(zhì)的排序機理[5]。

類似于其他過氧化物酶，血紅素近端配體的穩(wěn)定性由蛋白質(zhì)環(huán)境所決定。尤其是CPO半胱氨基酸上硫原子的穩(wěn)定性受帶正電的環(huán)境影響，所以其穩(wěn)定性可能和血紅素中鐵原子的還原電勢的增加有關(guān)[6]。CPO的還原電勢依賴于pH值：pH值為5.9時，其還原電勢為-140 mV；pH值為2.7時，其還原電勢為+150 mV。研究發(fā)現(xiàn)初始化合物I的形成對pH值不敏感，但化合物I的減少速率隨著pH值的減少其還原電勢呈增長趨勢[7]。

圖1 CPO的晶體結(jié)構(gòu)

CPO活性位點的側(cè)視圖見圖2，包括CPO中一些重要的氨基酸，如谷氨酸(Glu183)、組氨酸(His105)、半胱氨酸(Cys29)、苯丙氨酸(Phe103)和苯丙氨酸(Phe186)。然而，CPO遠端不存在通常存在于其他過氧化物酶中的組氨酸和精氨酸。但很有趣的是His105距離血紅素丙酸酯為3.5?，同時His105也是錳的一個配體[8-9]。因此，His105在CPO發(fā)生催化反應(yīng)時是至關(guān)重要的。Glu183和His105形成H鍵，兩個Phe殘基可與親水底物相互作用。

圖2 CPO活性位點的側(cè)視圖

跨入CPO表面表象的片段如圖3所示，包括挨著蛋白質(zhì)的糖類。2個箭頭代表通向活性位點的2條通道，用洋紅色表示血紅素。鹵化物的結(jié)合位點2(黃，溴；藍，碘)位于窄通道和通道末端碘化物特異結(jié)合位點3之間，表明鹵化物從表面進入血紅素需通過這條窄通道。從血紅素活性中心延伸到酶表面有2條底物進入通道：一條窄通道和一條寬通道，進入方式取決于其物理特性。大多數(shù)鹵化物的結(jié)合位點位于窄通道，這表明了活性鐵中心鹵化物的進入通道。窄通道是由血紅素中心龐大的疏水性殘基組成，且由遠離活性中心的小的極性殘基組成。這樣的結(jié)構(gòu)便于其進入血紅素活性位點，也便于特定底物取向進入血紅素活性位點。盡管一個底物位點接近血紅素，但血紅素基團的丙酸酯邊緣不利于底物的進入，所以，CPO活性中心允許底物和血紅素鐵中心在一個特定的位置發(fā)生立體選擇性催化反應(yīng)[5]。

圖3 通過CPO表面表象的片段

2 CPO的反應(yīng)類型

在血紅素過氧化物酶家族中，CPO是發(fā)生反應(yīng)類型最多的一種酶。第1類是鹵化，用H2O2或其他過氧化物作為引發(fā)劑，鹵化物（除氟外）和易發(fā)生鹵化反應(yīng)的化合物作為底物(圖4)[10]。第2類與第1類非常相似，除了底物是尿酸之外。這兩種反應(yīng)在初始步驟可能會形成一個類似氯化的中間體，因此有最佳的酸性pH值[11-12]。第3類是一個典型的過氧化反應(yīng)，根據(jù)參與反應(yīng)有機底物的特性決定反應(yīng)的最佳pH值在4～7之間[13]。根據(jù)酶反應(yīng)的特異性，氯過氧化物酶可催化H2O2發(fā)生歧化反應(yīng)。最新研究表明，CPO能催化像細胞色素-P450的單加氧酶反應(yīng)(圖5)。另外，Dawson[14]發(fā)現(xiàn)CPO還能發(fā)生特定鹵代芳香族化合物的催化脫鹵反應(yīng)。

圖4 氯過氧化物酶催化鹵化反應(yīng)

圖5 氯過氧化物酶的催化氧化反應(yīng)

近年來，由于CPO能合成手性藥物，巨大的工業(yè)潛在價值吸引了國內(nèi)外眾多人士的眼球。據(jù)報道，CPO還能發(fā)生手性環(huán)氧化反應(yīng)、磺化氧化反應(yīng)和羥基化反應(yīng)，并具有較高的產(chǎn)率[15-17]。

CPO發(fā)生手性催化反應(yīng)的優(yōu)點是不需要提供NAD(P)H或其他電子供體，但在細胞色素P-450發(fā)生催化反應(yīng)時，必須提供。因此，CPO獨特的特性使其在工業(yè)應(yīng)用中，尤其是在手性藥物的合成，石油凈化和農(nóng)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域具有光明的應(yīng)用前景[18-20]。

3 CPO的固定化

由于CPO價格昂貴，易失活，且難以回收，導(dǎo)致其成本高，大大限制了其工業(yè)應(yīng)用。因此，提高CPO的穩(wěn)定性和重復(fù)使用率尤為重要，所以CPO的固定化成為當(dāng)今酶工程領(lǐng)域的研究熱點之一，關(guān)于CPO的固定化方法，近年來有一些報道。2010年，Jung[21]等在酸性條件下，以原硅酸四乙酯（TEOS）和非離子型嵌段共聚物P123為原料，合成大孔有序介孔分子篩SBA-15，再經(jīng)修飾產(chǎn)生酶共價結(jié)合點。進一步將CPO和葡萄糖氧化酶固定在此介孔分子篩上，用于吲哚的氧化實驗中，發(fā)現(xiàn)固定化CPO存儲數(shù)周不失活。此外，在固定床反應(yīng)器中連續(xù)操作，發(fā)現(xiàn)固定化酶不易浸出，這解決了工業(yè)應(yīng)用中酶的回收問題。2009年，Zhang[22]等通過共價交聯(lián)法，以殼聚糖為載體，戊二醛作交聯(lián)劑，制備了殼聚糖膜(球)固定化CPO。實驗表明，固定化酶熱穩(wěn)定性、對化學(xué)變性劑尿素和過氧化氫的耐受性均明顯提高。

磁性高分子微球是近年研制的一種新型高分子磁性固定化材料，是通過共聚或表面改性等方法將磁性無機粒子與有機高分子結(jié)合形成的具有一定磁響應(yīng)性及特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球。Zhang等[23]通過共價結(jié)合法以xMagTM異硫氰酸根末端磁性微球為載體固定CPO，pH為5.5，10 min后，酶載量可達25.59 mg/g，固定化率為75.5%。相對天然 CPO 而言，固定化CPO米氏常數(shù)Km值增大，與底物親和力減小，熱穩(wěn)定性、抗尿素、H2O2及各種有機溶劑的失活能力明顯增強，而且固定化CPO在重復(fù)使用16次后，其活力還有85%以上，遠遠高于天然CPO。

4 氯過氧化物酶的應(yīng)用

4.1 染料廢水

印染與染料廢水成分復(fù)雜，具有COD高，色澤深、酸堿性強、水質(zhì)變化大等特點，其凈化一直是當(dāng)今世界難題。隨著染料工業(yè)的迅猛發(fā)展，我國的水環(huán)境也受到嚴(yán)重的污染。那么尋求經(jīng)濟，綠色環(huán)保的凈化方法已迫在眉睫，研究表明采用生物酶催化降解是極具發(fā)展?jié)摿Φ木G色方法。2012年，張娟等[24]研究了H2O2存在的情況下，CPO對偶氮染料（橙黃Ⅳ和皂黃）的催化氧化。結(jié)果表明，加入H2O2，CPO對橙黃Ⅳ和皂黃具有較好的脫色降解效果，橙黃Ⅳ在5 min的脫色率達91.02%，皂黃在7 min的脫色率達88.83%。

4.2 手性化合物的合成

手性化合物是一類特殊的化合物，具有獨特的性質(zhì)，通常含手性因素的化學(xué)藥物所具有的對映異構(gòu)體在生物體內(nèi)的藥理活動，代謝過程及毒性存在顯著差異，如一個是藥物，而另一個卻有毒。由于CPO對有機底物具有手性識別功能，所以，CPO在手性藥物制備和新型手性催化劑的開發(fā)等領(lǐng)域具有潛在的價值。2012年，汪麗敏等[25]用CPO作催化劑，甲基芐基硫醚為原料，叔丁基過氧化氫(TBHP)為氧化劑，直接一步合成手性R-芐基甲基亞砜的反應(yīng)。結(jié)果表明：少量添加劑的引入可有效改善CPO的催化性能。

4.3 石油凈化

石油在提煉凈化過程中大致產(chǎn)生4類產(chǎn)品，分別為石油燃料，潤滑油和潤滑脂，瀝青質(zhì)和石油焦，石油溶劑和石油化工原料。瀝青質(zhì)是原油中最頑固的部分，利用化學(xué)法處理污染嚴(yán)重，使用生物酶處理，綠色環(huán)保且效果明顯。1993年，F(xiàn)edorak等[26]首次用生物酶CPO對富含石油卟啉環(huán)的瀝青質(zhì)進行酶法處理。2012年，Ayala[27]等在水含量為6.3%的三元體系中，利用CPO催化原油中的瀝青質(zhì)餾分。實驗表明，用殼聚糖共價交聯(lián)CPO后，可使本體系的總轉(zhuǎn)換數(shù)（TTN）提高10倍。熒光光度計顯示，用CPO處理過的瀝青質(zhì)中的芳香基降低了24%，表明生物轉(zhuǎn)化后的顯著變化。另一方面，溶解度譜分析表明：相對于未處理的瀝青質(zhì)而言，經(jīng)CPO處理的瀝青質(zhì)更難溶于甲苯中，在己烷存在下更容易產(chǎn)生沉淀物，這可能與極性原子的引入有關(guān)。能量色散型X射線光譜儀(EDS)表明：氯含量在原子基礎(chǔ)上增加了6倍。最后，在氮氣氣氛下的熱降解證明，經(jīng)CPO處理的瀝青質(zhì)更易反應(yīng)，從而產(chǎn)生更少的焦炭。

4.4 電化學(xué)領(lǐng)域

CPO固定到金、玻碳和熱解石墨電極表面，表現(xiàn)出良好的直接電子傳遞作用。CPO在催化底物的同時，氧分子被還原成水，在生物電子設(shè)備的研制中成為理想的生物電極陰極催化劑，如在神經(jīng)發(fā)育、血壓控制方面。所以，CPO在電化學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。2012年，田海濤等[28]將CPO與雙十二烷基溴化銨(DDAB)混合，涂于Nation修飾的玻碳電極表面，于表面再涂上殼聚糖，最后制得Chi/CPO-DDA B/Nafion/GC修飾電極。研究顯示，CPO與電極之間產(chǎn)生了直接的電子傳遞。說明CPO能催化氧化肉桂醇，生成肉桂醛。2010年，穆世磊等[29]利用雙十二烷基二甲基溴化銨將CPO固定于經(jīng)Nafion預(yù)處理的玻碳電極上。研究表明CPO可進行準(zhǔn)可逆的電子傳遞反應(yīng)，能將甲苯催化氧化為苯甲醛。

5 存在的問題及展望

作為一種生物催化劑，CPO具有良好的應(yīng)用前景。它在工業(yè)應(yīng)用中備受矚目，但各國學(xué)者對其研究還遠遠不夠，國內(nèi)關(guān)于CPO的報道更是鮮見。CPO的結(jié)構(gòu)和催化機理、如何通過物理和化學(xué)等手段進一步提高CPO的利用率還有待研究。今后可以考慮從以下幾方面進行探索：第一，CPO的結(jié)構(gòu)以及發(fā)生不同反應(yīng)的催化機理，應(yīng)通過先進的分析方法和手段對反應(yīng)過程中的中間體和活性自由基進行分析測定，詳述反應(yīng)機理；第二，探討CPO的來源、結(jié)構(gòu)和物化性能的關(guān)系，為其工業(yè)化生產(chǎn)打下理論基礎(chǔ)；第三，嘗試更多的載體固定CPO，減少酶失活同時能最大程度保持酶活力。更深入地研究CPO基礎(chǔ)理論及盡快使已取得的實驗成果上升到應(yīng)用階段，將成為今后研究CPO的重點。

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