陳紅英，徐建蓉，劉文靜，李學剛

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，西南綿陽 621010；2.西南大學藥學院，重慶 400716）

目前，國內(nèi)外學者均在積極地尋找具有清除自由基功能的有效藥物，抗氧化活性研究也成為研究和評價現(xiàn)代食品開發(fā)的重要內(nèi)容之一。黃連是常見中藥之一，為毛莨科植物黃連（Coptis chinensisFranch.）的干燥根莖，具有清熱燥濕、泄火解毒、抑菌、抗氧化等多種功效[1]。它的主要化學成分是小檗堿、黃連堿、表小檗堿、藥根堿和巴馬汀等幾種生物堿，其中小檗堿的含量最高，約為10%[2]。近研究表明黃連的很多活性如抗炎、降糖、抗癌等與其抗氧化作用有關[3-4]，其中五種主要生物堿具有不同程度清除自由基的活性，特別是小檗堿[5-6]。但事實上，黃連大多以煎劑或粉劑形式在臨床上使用，五種生物堿總量約占其中30%，而余下組分的作用則鮮有報道。為充分開發(fā)利用黃連藥材，所在課題組對黃連各組分的抗氧化作用進行了研究，以期為黃連各部分資源的效利用和黃連藥效物質(zhì)基礎研究提供一定科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃連藥材 來源于重慶石柱黃連GMP生產(chǎn)基地，由重慶西南大學藥學院李學剛教授鑒定，標本存放于西南大學藥學院黃連研究中心；色譜甲醇、色譜乙腈、其余試劑 均為分析純。

TBP-300B高速逆流色譜儀 上海同田生化公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Hypersil BDS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm） 大連依利特科學儀器有限公司；紫外分光光度計 上海UNICO公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA 上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風干燥箱 重慶實驗設備廠；

1.2 實驗方法

1.2.1 各組分的制備與含量測定 按照下列圖示分別制備各組分，并測定各組分的含量。

圖1 黃連組分分離流程圖Fig.1 Separation schematic of constituents from Coptis chinensis Franch

1.2.1.1 多糖制備與含量測定 參照方法[7]，稱取粉碎至20目的黃連粗粉置于索氏提取器中，用5倍量無水乙醇回流脫脂6h。濾渣揮干后，加入10倍水，80℃水浴回流提取1h。提取液調(diào)pH至中性，抽濾，濾液減壓濃縮至100mL。按照除蛋白、醇沉等步驟提取粗多糖。真空干燥后即得灰白色粉末狀的黃連粗多糖。多糖含量按照文獻[8]，用苯酚-硫酸法測定。以葡萄糖為對照制作標準曲線。

1.2.1.2 高速逆流色譜制備總堿及親水性組分 多糖提取后余液濃縮至干得浸膏，參照文獻[9]，選定溶劑體系為：0～300min，氯仿∶甲醇∶0.2mol/L HCl（4∶1.5∶2，v/v））；300min以后，氯仿∶甲醇∶0.2mol/L HCl（4∶2∶2，v/v）。上相為固定相，下相為流動相。稱取浸膏300mg，用流動相配成20mL的樣品溶液。將固定相以20mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀的分離柱中；開啟恒溫冷卻泵，溫度為25℃；打開主機，泵入流動相，設置轉(zhuǎn)速800r/min，流速2mL/min，波長254nm；待兩相體系平衡好后，把樣品溶液吸入分離柱中。

根據(jù)色譜工作站譜圖收集餾分。按峰收集1～5號峰，合并濃縮至干得總堿。固定相中溶液用氮氣吹出濃縮至干得親水性組分。HPLC分析按照藥典2010版黃連定量分析方法進行，流動相：乙腈-50mmol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50，其中含15mmol/L十二烷基磺酸鈉，磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20μL；檢測波長：254nm。

1.2.1.3 多酚含量測定 精密稱取黃連浸膏及親水性組分50mg，用水配制成1mg/mL的溶液，取0.5mL用水定容至50mL。按照文獻[10]用福林酚法測定多酚含量。以沒食子酸為對照品配制標準曲線。

1.2.2 抗氧化活性測試

1.2.2.1 線粒體ROS法 取新鮮兔腎臟按照方法[11]提取線粒體并保存。線粒體用顯微鏡觀察，應為藍綠色圓形顆粒。取已制備的兔肝線粒體懸液，按照文獻方法[10]測定活性氧。先加入pH7.2的緩沖液，然后加入兩種復合體I和II底物：谷氨酸鹽40mmol/L與琥珀酸鹽40mmol/L，最后加入探針51mmol/L DCFH-DA，終濃度為5μmol/L。反應總體積為400μL。VC作為陽性對照。藥物組設置高中低三個劑量，每個劑量三個重復且設置背景對照。加樣體積見下表，加樣順序為：緩沖液-底物-探針-線粒體。避光混合均勻后立即于熒光酶標儀下測定30min內(nèi)DCF的熒光強度（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長531nm）。熒光強度與時間的關系用線性回歸擬合處理，計算直線斜率。按以下公式計

其中：A0為空白對照液的吸光度，AX為加入待測溶液后的吸光度，AX0為待測溶液的空白吸收值。

1.2.2.3 O2-·的清除能力實驗 采用鄰苯三酚自氧化法[13]。在試管中加入50mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）2.8mL，0.1mL不同濃度的樣品溶液，于25℃保溫10min，然后加入0.1mL 25℃的60mmol/L的鄰苯三酚0.1mL，總體積3.0mL，迅速搖勻，在420nm處測定其吸光度值，每隔0.5min記錄一次。以0.1mL 10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚溶液作為待測溶液的空白吸收值。每個濃度測定三次，結果取其平均值。VC作為陽性對照。對O2－·的清除率可表示為：算抑制率。

抑制率（%）=[空白熒光斜率-（樣品熒光斜率-樣品背景熒光斜率）]/空白熒光斜率×100

1.2.2.2 DPPH·清除率 按照方法[12]，分別取三種不同濃度的各樣品溶液1.0mL，于試管中，加入3.0mL的DPPH溶液，室溫避光反應30min，同時以無水乙醇為空白，于517nm波長處測定吸光值。按下列公式計算樣品對DPPH自由基清除率。將實驗重復三次，求得清除率的平均值。VC作為陽性對照。

其中：△A0為未加待測溶液時鄰苯三酚自氧化速率；△A為加入待測溶液后的鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.2.4 ·OH清除實驗 采用水楊酸法[12]。在試管中加入9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇1mL和待測溶液1mL，最后加入8.8mmol/L H2O21mL。37℃反應0.5h后，12000r/min離心6min，然后以雙蒸水作參比，在510nm下測定吸光度。以9mmol/L FeSO41mL，9mmol/L水楊酸-乙醇1mL，待測溶液1mL和雙蒸水1mL作為待測溶液的本底吸收值。每一吸光值平行測3次，取其平均值。VC作為陽性對照。清除率計算公式同1.2.2.2。

2 結果與討論

2.1 組分制備結果分析

按照方法1.2.1.3，取黃連45g，采用水提取醇沉法，得到灰白色塊狀的黃連粗多糖0.6305g。余液濃縮至干后，按照分離流程圖得到其余各組分。

HSCCC利用物質(zhì)在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的差異實現(xiàn)分離，對樣品損失少，且不會引起組分變性。樣品在固定相（水相）與流動相（氯仿相）中不斷往復萃取，按照組分在兩相中分配系數(shù)的差異先后流出，據(jù)相似相溶原則，易隨流動相流出的為易溶于有機溶劑的弱極性組分，最后為易溶于水相的親水性組分。

圖2 HSCCC餾分在黃連浸膏HPLC圖譜上的分布圖Fig.2 Schematic of HSCCC fractions from Coptis chinensis Franch extracts in HPLC

餾分在HPLC圖上的分布見圖2，可見經(jīng)高速逆流色譜分離后，黃連浸膏分離后基本分成兩大塊：總生物堿部分、親水性組分（在氯仿-甲醇-水體系中更易溶解于水相）。其中總生物堿組分包括了五種主要生物堿，這部分是往往是大家關注的重點。而其余餾分則鮮有相關研究報道。餾分經(jīng)減壓濃縮至干，總生物堿組分占浸膏61.6%，而親水性的組分占37.2%，其余為加樣后隨即被流動相帶出的極弱性組分（因得到的量較少未做進一步實驗）。徐穎[14]曾用80%乙醇回流提取得浸膏，并結合離子對萃取，紫外分光光度法測得浸膏中總生物堿含量為31.49%±1.41%。此實驗中采用提取多糖后的水提取液濃縮后浸膏直接進行逆流色譜分離，在線監(jiān)測，按峰收集并HPLC跟蹤，最終得到總生物堿組分和親水性組分，此數(shù)據(jù)與我們前期實驗用黃連粗粉用溶劑體系直接溶解后進樣得到的結果非常相似。

2.2 多酚與多糖含量測定結果與分析

普遍認為，中藥材的抗氧化活性與多酚含量有關[15-16]。因此，本實驗用福林酚法測定了浸膏和親水組分中多酚的含量。用沒食子酸為對照，標準曲線方程：y=0.0998x+0.0426，R2=0.9992，線性范圍為0～0.4g/L。以100g樣品中沒食子酸當量表示，黃連浸膏中多酚含量為1.65g/100g，親水性組分中多酚含量相當于沒食子酸當量為（35.2±2.28）g/100g。醇提浸膏中多酚含量與文獻[17]一致，親水組分中多酚含量較高估計與其含有阿魏酸、綠原酸、木蘭堿等酚酸組分有關。

按照方法1.2.1.3，用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為對照，繪制的標準曲線方程為y=0.0074x+0.0016，R2=0.9976，線性范圍為：10～135μg/mL。黃連中多糖含量為0.3586%，粗多糖中多糖含量為39.47%。與文獻[18]結果測得黃連藥材中多糖含量為0.32%～0.81%，粗多糖中含量約30.96%～55.45%基本一致，只是文獻采用堿提取，木瓜酶與Sevag法結合除蛋白，粗多糖的純度較高。

2.3 抗氧化活性結果與分析

活性氧（ROS）有酶源性、非酶源性、線粒體性等多種來源，其中線粒體呼吸鏈是ROS的主要途徑，包括有O2-·、·OH、H2O2等許多種類。O2-·是機體內(nèi)壽命最長的自由基，通常是自由基反應的引發(fā)劑；·OH是體內(nèi)最活潑的活性自由基。實驗用不同的評價體系對黃連各組分的抗氧化活性進行了測試，結果見表1。維生素C的活性與相關文獻[19，10]基本上一致并作對照。

線粒體ROS法和DPPH法主要體現(xiàn)總抗氧化能力，從表1中可看出兩法測定結果大體趨勢一致，浸膏的總抗氧化能力最強，而親水性組分略低于總堿的活性，多糖的抗氧化活性相對較弱，但也呈現(xiàn)較強的抗氧化活性，這似乎與黃連在臨床上多用粗粉或水提液藥用一致。親水性組分的抗氧化活性估計與其含有較高含量的多酚物質(zhì)比如阿魏酸、木蘭堿、綠原酸等有關。因此也說明黃連中某些成分含量雖少，但與其他成分并存時，卻可能存在協(xié)同增效的作用。

表1 各化合物抗氧化活性結果Table 1 Antioxidant activity of compounds

從對兩種自由基的清除作用來看，總堿的優(yōu)勢較明顯，均強于親水性組分，特別是對O2－·的清除作用明顯優(yōu)于其他組分，IC50為85mg/mL，說明幾種主要生物堿對O2－·的清除作用顯著。從對·OH的清除作用比較，浸膏的效果占優(yōu)，甚至優(yōu)于總堿，親水性組分也表現(xiàn)出較明顯的作用，這與文獻[20]報道基本一致，說明對·OH產(chǎn)生清除作用的多為一些親水性成分。楊澄等[18]也認為黃連炮制后，清除·OH的能力顯著降低，水提物的清除能力明顯優(yōu)于醇提物，而與之相反，對O2－·的清除作用卻是醇提物清除活性強于水提物，可能原因是醇提物中生物堿等小分子含量高于水提物，減少了蛋白質(zhì)、多糖等溶出的原因。多糖對兩種自由基均呈現(xiàn)一定的清除效果。

3 結論

用HSCCC可一次性無損失的完全分離黃連中的主要生物堿，并按分配系數(shù)差異進行組分分離；黃連的抗氧化活性成分并非只有幾種主要生物堿，其清除超氧自由基O2－·及清除·OH能力是黃連生物堿及其他組分合力而為。黃連抗氧化作用機制較多，要闡明其抗氧化作用的物質(zhì)基礎需要建立合適的活性評價體系，并進一步加大分離提取工作。

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