趙勝錦，張 放

（浙江大學(xué)果樹科學(xué)研究所，浙江杭州 310058）

中國(guó)櫻桃（Prunus psedoerasus Lindl.）屬于薔薇科落葉喬木果樹，是我國(guó)南方主栽的櫻桃種類。其果實(shí)味美形嬌，營(yíng)養(yǎng)豐富，但采后易迅速軟化，不利于貯運(yùn)。軟化是果實(shí)從成熟到衰老的必然生理過程，表現(xiàn)為果肉硬度下降、質(zhì)地變軟、果膠物質(zhì)降解、細(xì)胞壁酶活性變化[1-2]等。低溫貯藏是延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期的常用方法，降低溫度能顯著抑制果實(shí)呼吸、后熟、衰老和腐爛，有效控制果實(shí)成熟、保持果實(shí)品質(zhì)、延長(zhǎng)果實(shí)壽命[3]，其中近生物冰點(diǎn)貯藏能最大程度延長(zhǎng)水果的貯藏期[4-5]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)低溫貯藏對(duì)采后果實(shí)生理影響已在香蕉[6]、桃[7-8]、荔枝[9]、甜櫻桃[10]、藍(lán)莓[11]等水果上有所報(bào)道。而中國(guó)櫻桃在這方面的研究報(bào)道較少，對(duì)其采后軟化生理變化過程知之甚少。本文以中國(guó)櫻桃為研究對(duì)象，探討不同溫度貯藏下果實(shí)呼吸生理和貯藏品質(zhì)的變化特點(diǎn)，以及對(duì)果膠組分和相關(guān)酶活性的影響。研究結(jié)果可進(jìn)一步揭示不同溫度貯藏果膠組分及果膠酶的變化特點(diǎn)，探討中國(guó)櫻桃采后軟化機(jī)理，為其貯運(yùn)保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國(guó)櫻桃 品種為‘烏皮櫻桃’，2013年5月采自浙江諸暨市（同山鎮(zhèn)中源村）櫻桃園，選擇樹齡5年、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的櫻桃樹，采收成熟度以果實(shí)鮮紅為基準(zhǔn)，對(duì)樹冠中部的果實(shí)進(jìn)行采收，采后立即運(yùn)回浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行預(yù)冷，選擇大小均勻、成熟度一致、無機(jī)械損傷、無病蟲害的果實(shí)，按每袋200g裝入櫻桃專用薄膜袋。

UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本SHIMADZU（島津）公司；CheckpointⅡO2/CO2檢測(cè)儀 丹麥PBIDansensor（丹圣）公司；MiniScan EZ-MSEZ便攜式色差儀 美國(guó)HunterLab（亨特立）公司；TA-XT Plus物性分析儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；AtagoN-1a手持折光儀 日本ATAGO（愛拓）公司；5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf（艾本德）公司；XMT-102溫度數(shù)顯調(diào)節(jié)儀 余姚金電儀表有限公司；BS323S精密電子天平 德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將采后的中國(guó)櫻桃分別置于（0±0.5）、（4±0.5）、（20±0.5）℃冰柜中貯藏，相對(duì)濕度90%～95%。取樣時(shí)間為采后0、2、4、6、8、12、16d，測(cè)定果實(shí)生理指標(biāo)；其余果實(shí)去核、液氮冷凍并置于-40℃貯藏待測(cè)。

1.2.2 果實(shí)生理指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1 呼吸速率的測(cè)定 將果實(shí)置于密閉容器1h，用O2/CO2檢測(cè)儀測(cè)定CO2含量，單位以mg/（kg·h）表示。

1.2.2.2 腐爛率的測(cè)定 果實(shí)表面有腐爛斑點(diǎn)者為腐爛果，計(jì)算公式：腐爛率（%）=（腐爛果/調(diào)查總果數(shù)）×100[12]。

1.2.2.4 果肉硬度的測(cè)定 用物性分析儀測(cè)定果實(shí)去皮硬度，圓形探頭直徑5mm，測(cè)試深度4mm，貫入速度1mm/s對(duì)縫合線兩側(cè)果面進(jìn)行去皮測(cè)定。

1.2.2.5 可溶性固形物的測(cè)定 用手持折光儀測(cè)定可溶性固形物。

1.2.2.6 可滴定酸的測(cè)定 用0.1mol/L NaOH滴定至pH達(dá)到8.2，結(jié)果轉(zhuǎn)化為蘋果酸等價(jià)物[7]。

1.2.3 果膠的提取與測(cè)定 將中國(guó)櫻桃研磨成勻漿，用95%乙醇進(jìn)行多次沸水浴，以Molish反應(yīng)判斷樣品中已去除糖分，提取乙醇不溶物（AIS）[8，13]，真空干燥。取100mgAIS，用ddH2O和50mmol/L Na2CO3（含20mmol/L NaBH4）先后提取水溶性果膠（WSP）和原果膠（SSP）[14]。WSP和SSP含量的測(cè)定采用咔唑比色法在波長(zhǎng)530nm測(cè)定OD值，以半乳糖醛酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.2.4 細(xì)胞壁相關(guān)酶的提取與測(cè)定 多聚半乳糖醛酸酶（PG）的提?。喝?.5g果肉，用1.0mol/L NaCl（pH6.0）4℃振蕩提取30min，上清液用飽和（NH4）2SO4溶液鹽析[16-17]，沉淀再溶于0.15mol/L NaCl（pH6.0）得提取液。酶活性測(cè)定以多聚半乳糖醛酸（PGA）為底物，用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定反應(yīng)生成的D-半乳糖醛酸含量，測(cè)定條件：波長(zhǎng)540nm，VDNS/V總體系=4/8，反應(yīng)溫度100℃，反應(yīng)時(shí)間5min，酶活性單位U=mg/（g·h）[18]。β-半乳糖苷酶（β-Gal）提?。喝?.5g果肉，用1.0mol/L NaCl（pH6.0）4℃振蕩提取30min，上清液即酶提取液。酶活測(cè)定以對(duì)硝基酚半乳糖苷（PNPG，美國(guó)Sigma公司）為底物，37℃反應(yīng)15min，用10mmol/L Na2B4O7終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)400nm測(cè)定反應(yīng)生成的對(duì)硝基苯酚含量，酶活性單位U=nmol/（g·min）[19]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以上每組處理設(shè)置3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SE）；并使用SAS軟件分別對(duì)硬度與WSP、SSP，WSP、SSP與PG、β-Gal進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度貯藏對(duì)中國(guó)櫻桃生理指標(biāo)的影響

2.1.1 對(duì)腐爛率的影響 中國(guó)櫻桃在20℃貯藏下腐爛率上升最快，至第4d時(shí)達(dá)到100%，完全失去貯藏性，說明中國(guó)櫻桃不耐貯藏。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)中國(guó)櫻桃20℃貯藏4d后的相關(guān)生理指標(biāo)不再進(jìn)行測(cè)定（圖1）。20℃貯藏第1d中國(guó)櫻桃就開始腐爛，在4℃貯藏下則推遲4d才出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，而在0℃貯藏前8d均無腐爛發(fā)生，說明降低貯藏溫度能推遲腐爛的發(fā)生，且溫度越低越遲出現(xiàn)腐爛。中國(guó)櫻桃在4℃貯藏第8d后，腐爛率開始迅速上升，至第16d時(shí)達(dá)到64.62%，果實(shí)品質(zhì)顯著下降。而0℃貯藏第16d時(shí)腐爛率僅為9.45%，未失去貯藏性，說明0℃比4℃更有利于中國(guó)櫻桃貯藏，且其貯藏時(shí)間不低于16d。

圖1 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃腐爛率的變化Fig.1 Changes in rotting rate of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.2 對(duì)呼吸速率的影響 呼吸速率與果實(shí)成熟衰老密切相關(guān)，采后呼吸作用越旺盛，各種生理生化進(jìn)程就越快，貨架壽命就越短[20]。中國(guó)櫻桃采收時(shí)呼吸速率為12.95mg/（kg·h），20℃貯藏下呼吸速率急速上升，在第2d達(dá)到最大值19.85mg/（kg·h），比采收時(shí)上升53.31%，而在4℃和0℃貯藏下分別推遲2d和6d出現(xiàn)呼吸高峰，且呼吸速率值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于20℃呼吸高峰，推測(cè)中國(guó)櫻桃呼吸類型屬于晚峰型（Late Peak Type）[3]，貯藏溫度不會(huì)影響呼吸高峰的出現(xiàn)，但溫度降低其呼吸速率越?。▓D2）。貯藏溫度越低，中國(guó)櫻桃的呼吸速率下降越顯著。4℃貯藏第2d時(shí)中國(guó)櫻桃呼吸速率為6.37mg/（kg·h），比采收時(shí)下降50.84%，0℃貯藏第4d時(shí)達(dá)到最小值2.49mg/（kg·h），比采收時(shí)下降80.77%，因此低溫抑制呼吸速率是抑制果實(shí)腐爛、延長(zhǎng)貯藏時(shí)間的重要因素。

圖2 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃呼吸速率的變化Fig.2 Changes in respiration rate of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.3 對(duì)果肉硬度的影響 硬度下降是果實(shí)軟化最主要的直觀表現(xiàn)。中國(guó)櫻桃采收硬度不高，為1.86N。20℃貯藏下，中國(guó)櫻桃果肉硬度下降最迅速，至第4d時(shí)降至1.36N，平均日下降11.83%，說明中國(guó)櫻桃采后果肉硬度下降迅速，不耐貯藏（圖3）。而在4℃貯藏下，中國(guó)櫻桃果肉硬度在前6d無明顯變化，但在貯藏后期有所下降，至第16d時(shí)降至1.40N，說明降低貯藏溫度能延緩中國(guó)櫻桃采后果肉硬度下降。在0℃整個(gè)貯藏過程中，果肉硬度均保持較高水平，且在貯藏前6d有所上升，貯藏后期無明顯下降，這與甜櫻桃在近生物冰點(diǎn)貯藏下果肉硬度變化的結(jié)果一致[5]。

圖3 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃果肉硬度的變化Fig.3 Changes in fresh firmness of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.1.4 對(duì)果皮色差的影響 色差是評(píng)價(jià)果實(shí)成熟度和品質(zhì)的重要指標(biāo)。采收時(shí)中國(guó)櫻桃果皮呈鮮紅色，總色差值（△E）為65.13，在20℃貯藏4d后明顯上升至68.93，這是因?yàn)楣ぜt色不斷加深所導(dǎo)致（表1）。在4℃貯藏下，△E在第4d短暫下降后持續(xù)上升至70.02（6d），并保持在較高水平，說明4℃貯藏?zé)o法抑制果皮色澤向暗紅色轉(zhuǎn)變。在0℃貯藏下中國(guó)櫻桃在第4～8d內(nèi)明顯下降，但之后迅速上升至69.71，說明0℃能在貯藏前期延緩果皮色澤變暗。

2.1.5 對(duì)可溶性固形物和可滴定酸的影響 果實(shí)風(fēng)味是評(píng)價(jià)商品價(jià)值的重要指標(biāo)，主要用糖酸比來表示，可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）含量發(fā)生變化均會(huì)產(chǎn)生影響。采收時(shí)中國(guó)櫻桃糖酸比為8.07，20℃貯藏2d后上升并保持在10.85左右，其原因?yàn)門A持續(xù)下降、而TSS則先上升后下降（表2）。隨著貯藏溫度的下降，TSS上升和TA下降的趨勢(shì)均變緩，因此糖酸比在4℃和0℃貯藏分別在6d和8d后才快速上升。在4℃和0℃貯藏16d時(shí)，糖酸比均達(dá)到最大值13.55和14.55，主要是因?yàn)門A持續(xù)下降而TSS含量仍保持在較高水平。

2.2 不同溫度貯藏對(duì)中國(guó)櫻桃果膠變化的影響

研究認(rèn)為，果膠酶及其引起的果膠組成的變化是細(xì)胞間粘合力下降的主要原因[21]。中國(guó)櫻桃果實(shí)中原果膠（SSP）在采收時(shí)的含量最高，達(dá)到15.82mg/100mgAIS，水溶性果膠（WSP）含量則最低，為4.22mg/100mgAIS（圖4）。伴隨著果實(shí)硬度下降，中國(guó)櫻桃的SSP不斷降解為WSP，WSP不斷升高。相關(guān)性分析表明，SSP與硬度變化呈正相關(guān)（r=0.74），而WSP與硬度變化呈負(fù)相關(guān)（r=-0.58），說明果實(shí)硬度下降與WSP和SSP含量的變化有關(guān)，推測(cè)果膠降解導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，從而導(dǎo)致果肉硬度迅速下降。20℃貯藏下SSP降解為WSP最為迅速。如圖4所示，20℃貯藏下SSP平均日下降7.48%，WSP前3d平均日上升21.13%，但在第4d時(shí)WSP明顯下降，這可能與果實(shí)腐爛，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞有關(guān)。4℃貯藏下，SSP貯藏前12d平均日下降2.50%，WSP平均日上升2.94%，說明降低溫度能顯著抑制WSP上升和SSP下降的速率。而在0℃貯藏過程中，SSP在貯藏前4d無明顯變化，貯藏6d后含量有明顯上升趨勢(shì)，之后開始迅速下降，但仍高于4℃同期；WSP在貯藏前4d呈明顯下降趨勢(shì)，在第4d達(dá)到最小值2.92mg/100mgAIS，比4℃條件下低31.69%，之后又迅速上升，在第12d時(shí)達(dá)到4℃相同水平。這些結(jié)果說明，低溫能有效地抑制SSP的下降和WSP含量的上升，而且在貯藏前期更為明顯。

表1 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃色差的變化Table 1 Changes in Chromatic aberration of Chinese cherry fruit during different temperature storage

表2 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃可溶性固形物和可滴定酸含量的變化Table 2 Changes in TSS and TA of Chinese cherry fruit during different temperature storage

圖4 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃果膠的變化Fig.4 Changes in pectin of Chinese cherry fruit during different temperature storage

2.3 不同溫度貯藏對(duì)中國(guó)櫻桃果膠酶活性的影響

多聚半乳糖醛酸酶（PG）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）被認(rèn)為與許多果實(shí)軟化密切相關(guān)，如桃[7，22-23]、青梅[14]、梨[24-25]等，但不同果實(shí)中PG和β-Gal活性變化不同，如PG在整個(gè)成熟期均不對(duì)酸櫻桃軟化起作用[26]，但卻是甜櫻桃軟化主導(dǎo)酶之一[27]。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，中國(guó)櫻桃果實(shí)PG和β-Gal與SSP（rPG=-0.64、rβ-Gal=-0.73）存在負(fù)相關(guān)，與WSP（rPG=0.87、rβ-Gal=0.83）正相關(guān)，說明PG和β-Gal與SSP降解為WSP密切相關(guān)，是導(dǎo)致果實(shí)硬度下降的重要原因。中國(guó)櫻桃20℃條件貯藏，PG和β-Gal活性均迅速上升，第3d時(shí)均達(dá)到最大值，為0.63mg/（g·h）和30.77nmol/（g·min），分別是采收時(shí)的1.16倍和2.17倍。貯藏第4d時(shí)PG和β-Gal活性均顯著下降，這可能與果實(shí)腐爛有關(guān)。在低溫貯藏下PG和β-Gal活性均受到不同程度抑制。0℃貯藏時(shí)PG活性顯著下降，與段學(xué)武等[6]報(bào)道的冷激處理抑制香蕉的PG酶活性的結(jié)果一致，第2d迅速降至0.47mg/（g·h），直至第8d后才開始明顯上升，而在4℃貯藏下PG活性在第6d后就開始上升，說明溫度越低越能抑制PG酶活性（圖5）。低溫對(duì)β-Gal酶活性抑制作用更為明顯，0℃對(duì)β-Gal活性抑制最為顯著，在貯藏第4d達(dá)到最小值8.56nmol/（g·min），遠(yuǎn)低于4℃條件下貯藏，β-Gal活性。4℃貯藏較好抑制了貯藏前期的β-Gal活性，但第8d后β-Gal活性迅速上升至第12d達(dá)到最大值30.68nmol/（g·min），遠(yuǎn)高于0℃貯藏下β-Gal活性水平（圖6）。以上結(jié)果說明，PG和β-Gal是參與中國(guó)櫻桃果實(shí)軟化的重要酶，其酶活性的升高很有可能是引起原果膠降解的重要原因，貯藏溫度越低越能抑制其活性，從而延緩果膠物質(zhì)降解，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。與PG相比，β-Gal與果膠組分變化關(guān)系更為密切，對(duì)低溫抑制也更敏感，與中國(guó)櫻桃軟化密切相關(guān)。

圖5 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃多聚半乳糖醛酸酶的變化Fig.5 Changes in PG of Chinese cherry fruit during different temperature storage

圖6 不同溫度貯藏下中國(guó)櫻桃β-半乳糖苷酶的變化Fig.6 Changes in β-Gal of Chinese cherry fruit during different temperature storage

3 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，低溫貯藏可顯著抑制中國(guó)櫻桃采后呼吸速率，降低腐爛率，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，該結(jié)果與甜櫻桃[5]、桃[28]表現(xiàn)一致。降低貯藏溫度能明顯抑制中國(guó)櫻桃軟化進(jìn)程，主要原因是低溫延緩了PG和β-Gal酶活性上升，進(jìn)而抑制了果膠的降解，對(duì)保持中國(guó)櫻桃硬度起到重要作用。0℃貯藏對(duì)抑制中國(guó)櫻桃果實(shí)采后呼吸速率和腐爛率的效果明顯優(yōu)于4℃，但對(duì)果皮色差和糖酸比等貯藏品質(zhì)的影響區(qū)別不大。

綜上所述，低溫貯藏在整體上有利于抑制果實(shí)腐爛、延長(zhǎng)貯藏時(shí)間、維持果實(shí)品質(zhì)。從貯藏效果和生產(chǎn)成本等綜合考慮，0℃貯藏更適宜于中國(guó)櫻桃貯藏，可以推廣應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

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