陳宇哲，傅 亮，彭 英

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632）

表面發(fā)酵是好氧液態(tài)發(fā)酵的一個(gè)重要分支，民間延續(xù)歷史悠久，常用于米醋生產(chǎn)，風(fēng)味品質(zhì)獨(dú)特，但工藝及設(shè)備極為簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率低，已不能適應(yīng)現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的要求［1］。以該法釀制廣式米醋為例，先以糙米等釀制米酒，接種醋酸菌，靜置于缸內(nèi)發(fā)酵40～50d。發(fā)酵中后期會(huì)在發(fā)酵液表面形成一層細(xì)菌纖維素膜，這是表面發(fā)酵的主要特征［2］。文獻(xiàn)表明維持細(xì)菌纖維素膜的完整性對(duì)發(fā)酵起重要作用，一旦膜的形態(tài)被破壞，則發(fā)酵總酸遠(yuǎn)低于預(yù)期［3］。常用的好氧發(fā)酵罐在攪拌、通氣、補(bǔ)料等環(huán)節(jié)易在液體內(nèi)部產(chǎn)生較大剪切力，破壞纖維素膜的完整性導(dǎo)致發(fā)酵失敗。這是表面發(fā)酵一直停留在傳統(tǒng)的大缸或池內(nèi)進(jìn)行且難以自動(dòng)化連續(xù)化的主要原因，也導(dǎo)致了表面發(fā)酵產(chǎn)品越來越被生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者放棄，甚至以配制品替代?；诖吮尘凹扒捌谘芯拷Y(jié)果，本文研制了一種填料塔式發(fā)酵裝置，旨在徹底改良傳統(tǒng)表面發(fā)酵方式，使其操作實(shí)行自動(dòng)化、連續(xù)化及參數(shù)調(diào)整彈性化。并在此基礎(chǔ)上探討補(bǔ)料操作釀制米醋的可行性，研究結(jié)果有助于生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行技術(shù)革新。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 木醋桿菌RF4，分離自廣州如豐果子調(diào)味食品有限公司米醋車間，經(jīng)16S rDNA鑒定為葡糖醋酸桿菌屬的木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）［4］;無水乙醇、氫氧化鈉、葡萄糖、重鉻酸鉀、濃硫酸、3，5－二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉 均為分析純;酵母粉 英國(guó)oxoid。

HR－120電子天平 上海精密;YQX－SG46－280S高壓蒸汽滅菌器 上海博迅;SW－CJ－1BU超凈工作臺(tái) 蘇州安泰;PYX－190－A生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn);722s可見光分光光度計(jì) 上海菁華;HL－1恒流泵 上海滬西;PHS－3C型pH計(jì) 上海精科;DHG－9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī) 上海一恒。

1.2 種子培養(yǎng)及發(fā)酵液

種子培養(yǎng)液:10g/L葡萄糖、10g/L酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃加入5%（V/V）乙醇，自然冷卻后挑取RF4菌株接種，30℃培養(yǎng)6d。菌檢計(jì)數(shù)為3.36×106CFU/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)液:10g/L葡萄糖、10g/L酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃后按不同濃度（V/V）需要補(bǔ)入相應(yīng)乙醇。

1.3 填料塔式發(fā)酵裝置

以下簡(jiǎn)稱裝置。填料柱（圖1標(biāo)注5）為定制空心玻璃柱內(nèi)徑30mm，長(zhǎng)700mm，上端開口處以4層消毒紗布包裹，以利空氣進(jìn)入，內(nèi)填充絮狀滌綸絲，填充段長(zhǎng)度400mm，填充密度23kg/m3。玻璃柱下方連接 500mL三角瓶?jī)?chǔ)罐（圖1標(biāo)注 2），裝液量250mL。恒流泵將發(fā)酵液以10mL/min的流速泵入玻璃填料柱頂部，經(jīng)重力分配后流經(jīng)滌綸纖維層回到儲(chǔ)罐?；亓鬟^程中，含菌發(fā)酵液在絮狀滌綸纖維上產(chǎn)生纖維素膜并附著。同時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液參數(shù)，并可通過酒精儲(chǔ)罐補(bǔ)入酒精，發(fā)酵溫度30℃。整套裝置使用前經(jīng)過紫外燈滅菌并用70%（V/V）酒精擦拭。

圖1 填料塔式發(fā)酵裝置示意圖Fig.1 Packing－tower fermentation system

1.4 靜置及裝置補(bǔ)料發(fā)酵

實(shí)驗(yàn)分4組，均為500mL三角瓶裝液量250mL，初始酒精度均為5.0%（V/V），接種量5%（V/V），培養(yǎng)溫度30℃。4組中靜置單批發(fā)酵即靜置培養(yǎng)且中途不補(bǔ)料;靜置補(bǔ)料發(fā)酵自發(fā)酵第6d起每隔2d補(bǔ)入5mL酒精共3次，注意補(bǔ)料時(shí)酒精沿容器內(nèi)壁緩慢注入，保證不破壞表面的纖維素膜;裝置單批發(fā)酵中途不補(bǔ)料;裝置補(bǔ)料發(fā)酵則自發(fā)酵第6d起每隔2d補(bǔ)入5mL酒精共3次。

以上4組測(cè)定每組達(dá)到最高酸度及對(duì)應(yīng)時(shí)間、酒精消耗量、產(chǎn)酸率和纖維素產(chǎn)量。

1.5 裝置分批補(bǔ)料操作

1.5.1 裝置不同初始濃度分批補(bǔ)料發(fā)酵 調(diào)整初始酒精度從2.0%～6.0%（V/V）共5組，自第2d起每隔24h檢測(cè)酒精濃度，并補(bǔ)充至初始濃度。檢測(cè)最高酸度、達(dá)到最高酸度所需時(shí)間和纖維素產(chǎn)量。

1.5.2 裝置不同補(bǔ)料間隔的發(fā)酵 初始酒精度為5.0%（V/V），補(bǔ)料間隔為12、24、48h 共3 組，每次補(bǔ)料前檢測(cè)酒精度并補(bǔ)充至初始濃度。測(cè)定產(chǎn)酸及乙醇脫氫酶（ADH）活力的變化規(guī)律。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 總酸度測(cè)定 參照GB 5009.41－2003。

1.6.2 乙醇脫氫酶（ADH）活力測(cè)定 WOOD氏法［5］。

1.6.3 酒精度測(cè)定 重鉻酸鉀－DNS比色法［6］，酒精消耗量以總消耗酒精體積比每百毫升培養(yǎng)液表示。

1.6.4 纖維素產(chǎn)量測(cè)定 從發(fā)酵液中取出纖維素膜，用蒸餾水反復(fù)沖洗，再浸泡于0.1mol/L NaOH溶液中煮沸20min，再以蒸餾水沖洗后，80℃烘箱烘干至恒重［7］。纖維素產(chǎn)量單位以纖維素干重比每百毫升培養(yǎng)液表示。

1.6.5 產(chǎn)酸率 發(fā)酵液總酸度折合成乙酸質(zhì)量比實(shí)際消耗酒精理論可轉(zhuǎn)化的乙酸質(zhì)量（%）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均做3次平行，以3倍標(biāo)準(zhǔn)差法剔除異常值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以算術(shù)平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜置及裝置發(fā)酵結(jié)果比較

按1.4的操作，結(jié)果如表1所示。

從表1可知，裝置在單批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵操作中，最高酸度、產(chǎn)酸率均與靜置單批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵基本持平，同時(shí)達(dá)到最高酸度所需時(shí)間及纖維素產(chǎn)量有所減少。證明設(shè)計(jì)的裝置既可方便進(jìn)行補(bǔ)料操作，也有替代傳統(tǒng)靜置發(fā)酵的可行性。另靜置和裝置補(bǔ)料發(fā)酵相比于各自單批發(fā)酵組，最高酸度分別可提高71.1%和87.5%，纖維素產(chǎn)量分別提高了32.0%和14.2%，而產(chǎn)酸率維持基本一致的水平，補(bǔ)料底物主要轉(zhuǎn)化為酸，說明補(bǔ)料操作是制備高酸醋的有效途徑。

2.2 裝置補(bǔ)料發(fā)酵研究

2.2.1 酒精度對(duì)最高總酸及纖維素產(chǎn)量的影響 按1.5.1的操作，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，最高總酸與初始酒精度的高低呈正相關(guān)，5.0%（V/V）酒精度時(shí)最高總酸為7.17g/100mL，所需時(shí)間12d為5組中最短，比最慢的2.0%（V/V）酒精度提早3d。當(dāng)酒精度為6.0%（V/V）最高總酸開始下降，表明底物抑制出現(xiàn)。

表1 四種不同發(fā)酵方式比較Table 1 Comparison of four fermentation processes

圖2 初始酒精度對(duì)發(fā)酵最高總酸與纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial ethanol concentration on maximum total acidity and cellulose production

初始酒精度為2.0%（V/V）纖維素產(chǎn)量為0.31g/100mL，然后隨酒精度的升高而減少，說明在低酒精度下，發(fā)酵傾向于纖維素的合成，而高酒精度時(shí)傾向于產(chǎn)酸。制醋過程中應(yīng)盡可能使酒精轉(zhuǎn)化為乙酸而不是纖維素。初始酒精度為5.0%（V/V）是提高最高總酸的最佳選擇。碳源（乙醇）轉(zhuǎn)化為纖維素和酸的比例本是矛盾，站在制醋的角度，在初始酒精度為5.0%（V/V）時(shí)獲得最佳平衡。

2.2.2 補(bǔ)料頻率對(duì)產(chǎn)酸的影響 按1.5.2方法進(jìn)行補(bǔ)料操作，產(chǎn)酸曲線如圖3所示。3組不同補(bǔ)料頻率在發(fā)酵前4d酸度提升均較慢，第5d起開始進(jìn)入快速產(chǎn)酸期。12h間隔補(bǔ)料組在第10d達(dá)到最高酸度7.13g/100mL，24h與48h間隔補(bǔ)料組則分別在第12d及第13d達(dá)到最高酸度。總體而言，增加補(bǔ)料頻率有利于提高產(chǎn)酸速率，但對(duì)最高酸度基本沒有影響。

圖3 不同補(bǔ)料頻率對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of different feeding frequencies on acid production

2.2.3 補(bǔ)料頻率對(duì)ADH活力的影響 按1.5.2方法進(jìn)行補(bǔ)料操作，發(fā)酵第6d開始計(jì)時(shí)，48h內(nèi)每隔6h檢測(cè)3種方法的ADH活力。結(jié)果如圖4所示。補(bǔ)料操作的頻率影響了ADH活力。48h間隔補(bǔ)料組在補(bǔ)料前后均較低，補(bǔ)料中期ADH活力達(dá)到峰值后回落;24h間隔補(bǔ)料組的ADH活力最低點(diǎn)也出現(xiàn)在補(bǔ)料前后，在補(bǔ)料間隔中期體現(xiàn)出兩個(gè)峰值;12h間隔補(bǔ)料組的平均酶活力在3組中有最高值0.051U/g，并呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)?？s小補(bǔ)料間隔，有助于維持底物濃度的平穩(wěn)，有助于維持ADH活力保持高位，有助于提高產(chǎn)酸速率。

圖4 不同補(bǔ)料頻率對(duì)ADH活力的影響Fig.4 Effect of different feeding frequencies on ADH activity

3 討論與結(jié)論

表面好氧發(fā)酵生產(chǎn)傳統(tǒng)米醋，維持纖維素膜的完整性對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸至關(guān)重要。傳統(tǒng)方式效率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大，酸度低，操作彈性小。本文設(shè)計(jì)了一種填料塔式發(fā)酵裝置代替?zhèn)鹘y(tǒng)的大缸，并可方便補(bǔ)料，其它參數(shù)也容易實(shí)行彈性化，初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了裝置發(fā)酵效果和傳統(tǒng)靜置的基本持平，甚至稍有優(yōu)勢(shì)。整個(gè)系統(tǒng)完全進(jìn)行了改良，有良好的工業(yè)化發(fā)展前景。

補(bǔ)料操作是提高發(fā)酵總酸的有效途徑，靜置和裝置補(bǔ)料發(fā)酵相比于對(duì)照組，最高酸度分別可提高71.1%和87.5%。補(bǔ)料操作中，不同的初始底物濃度影響了底物轉(zhuǎn)化方向，低酒精度時(shí)傾向于合成纖維素，底物濃度提高有助于產(chǎn)酸。但底物濃度高于5.0%（V/V）時(shí)，底物抑制開始顯現(xiàn)，抑制產(chǎn)酸。

乙醇作為發(fā)酵的主要碳源，發(fā)酵產(chǎn)物可體現(xiàn)在產(chǎn)纖維素和乙酸兩方面。有報(bào)道證實(shí)［8］，乙酸只是纖維素合成的中間產(chǎn)物。制醋的理想狀態(tài)應(yīng)是盡量獲得較高的乙酸轉(zhuǎn)化率，減少纖維素的合成，但纖維素的合成并成膜又是產(chǎn)酸必不可少的因素，在本系統(tǒng)中，初始乙醇濃度在5.0%（V/V）時(shí)，獲得了良好平衡。

補(bǔ)料操作中，每次補(bǔ)料后維持底物濃度不變，改變補(bǔ)料頻率，則補(bǔ)料頻率越高，產(chǎn)酸速率越快，有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，但不能有效提高最高總酸度。其原因是提高補(bǔ)料頻率有助于維持發(fā)酵系統(tǒng)中以ADH為代表的酶活力處于較高水平。在生產(chǎn)中，可考慮實(shí)施恒底物濃度補(bǔ)料，甚至在維持底物濃度處于恒定條件下，進(jìn)行連續(xù)化操作。

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［2］徐瑩.發(fā)酵食品學(xué)［M］.鄭州:鄭州大學(xué)出版社，2010:142.

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