于張穎，肖 發(fā)，柳丹丹，翟 量，沈立榮

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

蜂王漿是工蜂咽下腺、上顎腺和腦后腺分泌的供蜜蜂幼蟲和蜂王食用的漿狀物，是決定蜜蜂幼蟲成為工蜂還是蜂王的關(guān)鍵因素［1］，對人體具有抗疲勞［2］、抗衰老［3］、免疫調(diào)節(jié)［4］等保健功能，作為營養(yǎng)保健品、藥品、化妝品在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用［5］。最新研究表明，占王漿總蛋白的82%～90%的主蛋白（Major Royal Jelly Proteins，簡寫MRJPs）是蜂王漿中最重要的活性成分，是代表蜂王漿質(zhì)量和新鮮度的標(biāo)志［1］。但目前國內(nèi)外市場的蜂王漿產(chǎn)品均為蜂王漿原漿或凍干粉加工品，很有必要對MRJPs進(jìn)行新產(chǎn)品的研究開發(fā)。

近年來國內(nèi)外已先后開展了離心［6］、堿提酸沉［7］、鹽提酸沉［7］、柱層析［8－10］等分離 MRJPs 的研究探索，但堿提酸沉、鹽提酸沉存在有機(jī)溶劑污染、影響蛋白活性、副產(chǎn)物浪費(fèi)等問題，柱層析則存在工藝復(fù)雜、成本偏高的問題，而離心分離具有操作簡便、對蛋白活性影響小、王漿酸和多糖等其它活性成分可回收利用的優(yōu)點(diǎn)。為此，我們開展了MRJPs離心分離和副產(chǎn)物回收利用及產(chǎn)物質(zhì)量分析研究，為蜂王漿深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮王漿 杭州碧于天保健品有限公司提供;Bradford蛋白定量試劑盒 上海杰瑞生物科技有限公司;中等分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、TMB顯色液試劑盒 上海澤衡生物科技有限公司;HRP－羊抗兔抗體 北京莊盟國際生物基因科技有限公;MRJP1多克隆抗體 采用本實(shí)驗(yàn)室重組表達(dá)的MRJP1免疫大白兔得到［11］。

pH計(jì) 賽德瑞斯公司;5804R型冷凍離心機(jī)艾本德中國有限公司;CP70MX超速離心機(jī) 日本Hitachi公司;752型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FD－1－50真空冷凍干燥機(jī) 南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司;蛋白電泳儀 美國Bio－Rad公司;2300自動(dòng)凱氏定氮儀 福斯賽諾分析儀器（蘇州）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MRJPs提取 稱取適量鮮王漿，按一定液料比（2～10mL/g）加入適當(dāng)濃度的 NaCl溶液（0.3～0.7mol/L），混勻，調(diào)節(jié) pH（5～9），4℃充分?jǐn)嚢枰欢螘r(shí)間（2～10h）后，4℃、12000r/min 離心 30min，取上清液即為MRJPs溶液，將MRJPs溶液和含糖分、王漿酸的沉淀分別冷凍干燥備用［6］。

用凱氏定氮法測定鮮王漿中蛋白質(zhì)含量（參考GB 9697－2008）［12］，Bradford 法（BSA 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白）測定提取上清液中可溶性蛋白MRJPs含量［13］。

MRJPs提取率（%）=上清液中蛋白質(zhì)量/所用鮮王漿中蛋白質(zhì)量×100

1.2.2 MRJPs提取工藝的優(yōu)化 通過單因素實(shí)驗(yàn)考察液料比、pH、抽提時(shí)間、離子強(qiáng)度對鮮王漿中MRJPs提取率的影響。液料比選擇 2、4、6、8、10mL/g五個(gè)水平，pH 選擇5、6、7、8、9 五個(gè)水平，抽提時(shí)間選擇2、4、6、8、10h 五個(gè)水平，離子強(qiáng)度（NaCl濃度）選擇0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol/L 五個(gè)水平，以 MRJPs提取率為考察指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上選擇適當(dāng)水平進(jìn)行了四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)（表1），以優(yōu)化MRJPs的提取工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal design

1.2.3 SDS－PAGE電泳分析 參考《分子克隆·第三版》［14］，對提取所得蛋白進(jìn)行 SDS－PAGE 電泳，采用12%分離膠，考馬斯亮藍(lán)法染色，對結(jié)果拍照分析。

1.2.4 MRJP1提取分離 參考Salazar－Olivo L A等人的方法［6］改進(jìn):稱取適量鮮王漿，用等質(zhì)量超純水稀釋混勻，充分抽提6h;混合液在245000×g、4℃條件下離心5h，出現(xiàn)分層現(xiàn)象后，將中間層取出，用2倍質(zhì)量超純水將中間層溶解，室溫下抽提1h，混勻;將該液在30000×g、6℃下離心30min，取上清;上清液在245000×g、6℃下離心5h，取沉淀，此沉淀即為MRJP1蛋白，－20℃保存。

1.2.5 ELISA法檢測MRJPs純度 我們前期研究已證實(shí)，MRJP1與MRJPs家族其它成員具有很高的同源性，MRJP1多克隆抗體可與MRJPs家族其它蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)［15］，因此本實(shí)驗(yàn)中以大腸桿菌中重組表達(dá)的MRJP1制備的多克隆抗體為一抗，以MRJP1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用間接ELISA法測定提取產(chǎn)物凍干粉中MRJPs蛋白含量。

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參考文獻(xiàn)［16］，將MRJP1溶于 CBS緩沖液（0.05mol/L，pH=9.6）中，配成10μg/mL的溶液，倍比稀釋后加樣于96孔板中，4℃包被過夜。PBST（0.05%）洗滌，5%脫脂牛奶37℃封閉1.5h。PBST洗滌，MRJPs全蛋白多克隆抗體（一抗，1∶5000稀釋）37℃孵育1h。PBST洗滌，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（二抗，1∶5000稀釋）37℃孵育0.5h。PBST洗滌，TMB顯色液室溫反應(yīng)15min后加入2mmol/L H2SO4終止顯色反應(yīng)。立即于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定450nm及630nm處吸光值。以O(shè)D450～OD630為縱坐標(biāo)，MRJP1濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 MRJPs定量分析 同法測定最佳提取條件下MRJPs提取液凍干粉（配成15μg/mL溶液）的MRJPs含量。

1.2.6 MRJPs凍干粉中水分和王漿酸測定 參照GB 9697－2008［12］測定 MRJPs凍干粉中水分和王漿酸的含量。

1.2.7 鮮王漿及MRJPs提取副產(chǎn)物中王漿酸和總糖測定 取鮮王漿及MRJPs提取副產(chǎn)物沉淀的凍干物，參照 GB 9697－2008［12］，采用分光光度法測定總糖含量，采用液相色譜法測定王漿酸含量，二者回收率的計(jì)算方法為:

王漿酸回收率（%）=沉淀中王漿酸質(zhì)量/所用鮮王漿中王漿酸質(zhì)量×100

總糖回收率（%）=沉淀中總糖質(zhì)量/所用鮮王漿中總糖質(zhì)量×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有實(shí)驗(yàn)均作三組平行，所得數(shù)據(jù)用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對MRJPs提取率的影響 在pH=7，抽提時(shí)間6h，離子強(qiáng)度0.5mol/L條件下，由圖1可知，液料比在2～10mL/g范圍內(nèi)，液料比越高，MRJPs提取率越高。其中，在2～4mL/g及8～10mL/g范圍內(nèi)，MRJPs提取率隨液料比增高而增長較快;在4～8mL/g范圍內(nèi)，MRJPs提取率隨液料比增高而增長緩慢?？紤]到生產(chǎn)過程中加水過多會(huì)帶來額外的脫水成本，選擇4、6、8mL/g作為正交實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平。

2.1.2 pH對MRJPs提取率的影響 由圖2可知，在液料比6mL/g，抽提時(shí)間6h，離子強(qiáng)度0.5mol/L條件下，當(dāng)pH在5～6范圍內(nèi)時(shí)，MRJPs提取率隨pH增高而快速增長;當(dāng)pH在6～7范圍內(nèi)時(shí)，MRJPs提取率隨pH增高而較快增長;當(dāng)pH在7～8范圍內(nèi)時(shí)，MRJPs提取率隨pH增高而略有增高;當(dāng)pH在8～9范圍內(nèi)時(shí)，MRJPs提取率隨pH增高而緩慢下降。根據(jù)提取率大小選擇pH7、8、9進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖1 液料比對MRJPs提取率的影響Fig.1 Effect of the ratio of solution to sample on MRJPs extraction rate

圖2 pH對MRJPs提取率的影響Fig.2 Effects of pH values on MRJPs extraction rate

2.1.3 抽提時(shí)間對MRJPs提取率的影響 在液料比6mL/g，pH=7，離子強(qiáng)度0.5mol/L條件下，抽提時(shí)間在2～10h范圍內(nèi)，MRJPs提取率隨抽提時(shí)間延長而提高。在2～4h范圍內(nèi)，MRJPs提取率隨抽提時(shí)間延長而快速提高;在4～10h范圍內(nèi)，MRJPs提取率隨抽提時(shí)間延長而緩慢提高。其結(jié)果見圖3。綜合考慮生產(chǎn)效率的影響，選用4、6、8h三個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 抽提時(shí)間對MRJPs提取率的影響Fig.3 Effect of extracting time on MRJPs extraction rate

2.1.4 離子強(qiáng)度對MRJPs提取率的影響 由圖4可見，在液料比6mL/g，pH=7，抽提時(shí)間6h條件下，離子強(qiáng)度為0.3～0.6mol/L時(shí)，隨著離子強(qiáng)度的增大，MRJPs提取率隨之提高;離子強(qiáng)度為0.6～0.7mol/L時(shí)，MRJPs提取率隨離子強(qiáng)度的增大而降低。綜合考慮提取率及脫鹽帶來的成本，選擇離子強(qiáng)度0.3、0.4、0.5mol/L進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

圖4 離子強(qiáng)度對MRJPs提取率的影響Fig.4 Effect of ionic strength on MRJPs extraction rate

以MRJPs提取率為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并對結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析。由表2和表3可知，影響MRJPs提取率的因素依次為:離子強(qiáng)度＞pH＞抽提時(shí)間＞液料比，但影響均不顯著（p＞0.05）。由表2可知，最佳條件組合為A3B2C3D3，即液料比8mL/g，pH8，抽提時(shí)間8h，離子強(qiáng)度0.5mol/L。按此優(yōu)化工藝作進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果MRJPs提取率達(dá)81.14%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Result of variance analysis

2.3 SDS－PAGE電泳檢測

根據(jù)MRJPs蛋白SDS－PAGE電泳圖（圖5）中的蛋白標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)，MRJPs標(biāo)蛋白條帶主要分布范圍在42.1～97.4ku，其中以分子量為57ku的條帶最明顯，與Kamakura等報(bào)道的MRJP1分子量一致［2］。同時(shí)，MRJP1的純化產(chǎn)物也顯示為分子量為57ku單一蛋白條帶，也符合已報(bào)道的 MRJP1蛋白特征［2］，說明MRJP1提取得到了單一蛋白。

2.4 MRJPs純度分析

圖5 MRJPs和MRJP1 SDS－PAGE電泳圖Fig.5 SDS－PAGE analysis of MRJPs and MRJP1泳道M:蛋白質(zhì)Marker。

MRJP1標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6，得到MRJP1與吸光度間的回歸方程:y=0.1100x+0.1239（R2=0.998，式中y為吸光度，x為MRJPs含量），將所測MRJPs凍干粉的吸光度（OD450－OD630=1.306±0.110）代入該式，換算得含MRJPs凍干粉純度為71.7%。

圖6 MRJP1標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of MRJP1

2.5 MRJPs凍干粉中水分和王漿酸含量分析

按照GB 9697－2008測得MRJPs提取物凍干粉含水分0.005%，王漿酸0.55%。

2.6 MRJPs提取副產(chǎn)物中王漿酸及總糖分析

鮮王漿及最佳條件下提取MRJPs產(chǎn)生的沉淀凍干物中王漿酸及總糖含量見表5。經(jīng)換算得副產(chǎn)物質(zhì)量為原料的2.68%，其中王漿酸和總糖回收率分別為2.91%和1.26%。

表4 鮮王漿和副產(chǎn)物中王漿酸及總糖分析結(jié)果Table 4 Analysis of 10－HDA and total sugar in fresh royal jelly and by－product

3 結(jié)論與討論

藍(lán)瑞陽等［7］報(bào)道的蜂王漿蛋白的鹽提酸沉法收率為83.62%，堿提酸沉法收率為75.17%，但該報(bào)道沒有做純度測定。本研究通過正交實(shí)驗(yàn)，得到了離心提取王漿主蛋白MRJPs的最佳工藝:液料比8mL/g，pH8，抽提8h，離子強(qiáng)度0.5mol/L。在此條件下，MRJPs提取率達(dá)到81.14%，產(chǎn)物純度達(dá)到71.7%。同時(shí)實(shí)現(xiàn)了副產(chǎn)物王漿酸和總糖的回收，使蜂王漿活性產(chǎn)物得到充分利用。此外，采用自制重組表達(dá)MRJP1多克隆抗體，通過ELISA法檢測了所提取MRJPs的純度，為蜂王漿深加工和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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