趙昆 黃敏麗 王淼 劉欣

雷帕霉素對(duì)視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用△

趙昆 黃敏麗 王淼 劉欣

雷帕霉素；Wistar大鼠； 缺氧誘導(dǎo)因子1α；視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷；細(xì)胞凋亡

目的探討雷帕霉素對(duì)視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion iniury，RIRI)的保護(hù)作用和機(jī)制。方法75只SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組25只。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組行前房灌注建立RIRI模型。實(shí)驗(yàn)組在前房灌注前2 h 按2 mg·kg-1劑量腹腔注射雷帕霉素，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水和DMSO。分別在再灌注后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h取3組視網(wǎng)膜標(biāo)本，HE染色法觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)形態(tài)及測(cè)量視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度；TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中凋亡細(xì)胞的表達(dá)；Real-time PCR檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1 α(hypoxia-inducible factor 1 α，HIF-1 α)mRNA 在視網(wǎng)膜組織的表達(dá)水平。結(jié)果再灌注后0 h，實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度為(137.55±7.76)μm，視網(wǎng)膜水腫較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組輕，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度為(162.26±6.41)μm，且實(shí)驗(yàn)組RGC空泡化現(xiàn)象較少；再灌注6 h以后實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度均較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組厚(均為P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組再灌注后12 h、24 h、48 h 的細(xì)胞凋亡情況明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(均為P<0.05)。再灌注后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜組織中HIF-1α mRNA表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組降低(均為P<0.05)。結(jié)論雷帕霉素對(duì)RIRI具有保護(hù)作用，HIF-1α表達(dá)水平的下調(diào)可能與該作用有關(guān)。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(5)：409-413]

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是指視網(wǎng)膜組織缺血、缺氧后恢復(fù)血液循環(huán)所致的損傷，如視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等均可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管的阻塞，視網(wǎng)膜缺血和循環(huán)障礙均可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜的嚴(yán)重?fù)p傷[1]。因此積極探索其發(fā)病機(jī)理、尋找有效的治療方法防止視網(wǎng)膜缺血再灌注所導(dǎo)致的視神經(jīng)損害具有重要意義。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1 α，HIF-1α)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，能與靶基因結(jié)合并通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，使機(jī)體在缺氧時(shí)產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，是哺乳動(dòng)物和人在缺氧條件下維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性物質(zhì)。大量的研究表明，HIF-1在RIRI中占有重要作用[2]。雷帕霉素是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制藥物，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面可抑制腦細(xì)胞凋亡并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在采用雷帕霉素作為保護(hù)劑，通過觀察RIRI后視網(wǎng)膜組織形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞凋亡、HIF-1α mRNA表達(dá)情況，探討其可能的保護(hù)作用及機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物模型及分組廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供的SPF級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠75只，體質(zhì)量200～250 g。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組25只大鼠。實(shí)驗(yàn)組在前房灌注前2 h腹腔注射雷帕霉素(2 mg·kg-1)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組給予等量DMSO和生理鹽水腹腔注射。實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組根據(jù)缺血后再灌注時(shí)間的不同，又分為再灌注后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

1.1.2主要試劑及儀器雷帕霉素(美國Gene Operation公司)，TUNEL試劑盒(德國Roche公司)，DAB顯色試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)，病理圖像分析系統(tǒng)(德國LEICA公司)。

1.2方法

1.2.1RIRI模型的建立按3 mL·kg-1的劑量將100 g·L-1水合氯醛腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行全身麻醉，使用鹽酸丁卡因滴眼液對(duì)角膜行表面麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳。輸液器連接4.5 號(hào)針頭行右眼前房穿刺，注意不要傷及虹膜和晶狀體，生理鹽水瓶連接輸液器，瓶內(nèi)液面高度調(diào)整在150 cm，檢查穿刺口無漏水，此時(shí)眼壓達(dá)到110 mmHg(1 kPa= 7.5 mmHg)左右，可觀察到眼底血管斷流、視網(wǎng)膜蒼白。持續(xù)60 min后緩慢降低輸液瓶的高度，可見視網(wǎng)膜變紅，拔出穿刺針頭[4]。

1.2.2標(biāo)本采集和處理分別于再灌注后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h采用腹腔注射過量麻醉處死大鼠，迅速摘除眼球。每組5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只眼球以40 g·L-1中性多聚甲醛固定24 h后，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將包埋好的眼球標(biāo)本前端以角膜中央定位，后端以視神經(jīng)根定位，前后方位視網(wǎng)膜全層連續(xù)切片，切片厚度4 μm。HE染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度的測(cè)量每只眼球取3張切片進(jìn)行分析，視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度(指視網(wǎng)膜內(nèi)界膜到外網(wǎng)狀層內(nèi)緣的距離)為距視盤邊緣200 μm處100 μm長度內(nèi)隨機(jī)取4點(diǎn)的平均厚度。應(yīng)用美國Image Pro plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4原位凋亡(TUNEL法)的檢測(cè)常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度酒精脫水；體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫封閉10 min；蛋白酶K消化10 min，TUNEL反應(yīng)液(TdT反應(yīng)液+標(biāo)記液)50 μL濕盒37℃孵育60 min，轉(zhuǎn)化劑-POD混合液50 μL濕盒37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸酒精分化，烘干，封片。普通光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)層及內(nèi)核層凋亡細(xì)胞的光密度值(凋亡細(xì)胞呈棕黃色)，即光密度值=總光密度值/總面積。

1.2.5Real-timePCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中HIF-1αmRNA表達(dá)將每組5個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只眼球視網(wǎng)膜取下，置于裝有Trizol試劑的EP管中。用超聲波粉碎視網(wǎng)膜組織，提取視網(wǎng)膜中的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度及純度。取2 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行擴(kuò)增。Real time PCR反應(yīng)在LightCycler480Ⅱ系統(tǒng)中進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s)。HIF-1α mRNA表達(dá)量的多少通過與內(nèi)參β-actin比較來反映。β-actin 上游引物:5’-GTACAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3’，下游引物:5’-ACCCATACCCACCATCACACC-3’，擴(kuò)增片段為199 bp;HIF-1α上游引物:5’-CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA-3’，下游引物:5’GCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCA3’，擴(kuò)增片段為100 bp。

2 結(jié)果

2.1大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)改變空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜層次清晰，各層細(xì)胞排列整齊密集，結(jié)構(gòu)完整。 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：缺血再灌注后0 h，視網(wǎng)膜組織水腫，其中神經(jīng)纖維層與內(nèi)網(wǎng)狀層明顯水腫、厚度顯著增加，RGC可見空泡、變性；再灌注后6 h視網(wǎng)膜各層明顯疏松，排列紊亂，RGC數(shù)目減少；再灌注后12 h視網(wǎng)膜水腫已顯著減輕，神經(jīng)纖維層扁平，內(nèi)核層厚度變薄，RGC排列較稀疏；再灌注后24 h視網(wǎng)膜水腫基本消失，主要表現(xiàn)為RGC數(shù)目減少，細(xì)胞變性，神經(jīng)纖維層明顯變薄，內(nèi)核層排列紊亂、輕度變薄，外核層沒有明顯的變化；再灌后48 h，視網(wǎng)膜內(nèi)層變薄，可見RGC有較多的缺失。實(shí)驗(yàn)組再灌注后0 h視網(wǎng)膜水腫較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組輕，視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度小于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；再灌后6 h、12 h、24 h、48 h實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度均超過實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，RGC排列較規(guī)整(圖1)。

Figure 1 Retinal HE staining (×400).A:Experimental control group at 12 hours after reperfusion;B:Experimental group at 12 hours after reperfusion;C:Experimental control group at 24 hours after reperfusion;D:Experimental group at 24 hours after reperfusion;E:Blank control group 視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400)。A：再灌注后12 h實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；B：再灌注后12 h實(shí)驗(yàn)組；C：再灌注后24 h實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；D：再灌注后24 h實(shí)驗(yàn)組；E：空白對(duì)照組

2.2大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度的比較空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度為(104.00±2.78)μm，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠再灌后不同時(shí)間視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度的比較見表 1，由表1可見：再灌后不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較Table 1 Comparison of inner retinal layer thickness between experimental group and experimental control group(±s，n=5，l/μm)

2.3TUNEL檢測(cè)凋亡細(xì)胞的表達(dá)情況空白對(duì)照組TUNEL染色未見明顯陽性細(xì)胞，再灌注后0 h實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組再灌注后6 h可見視網(wǎng)膜中出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，大多位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；12 h后凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)明顯增多；24 h后凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)達(dá)頂峰，多見于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層；48 h后凋亡細(xì)胞陽性染色開始減少，主要見于RGC層。實(shí)驗(yàn)組凋亡改變出現(xiàn)同實(shí)驗(yàn)對(duì)照組有相似的趨勢(shì)，再灌注12 h、24 h、48 h凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)明顯少于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05；見表2、圖2 )。

表2 實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡比較Table 2 Comparison of positive expression of RGC apoptosis between experimental group and experimental control group(±s，n=5)

2.4Real-timePCR測(cè)定視網(wǎng)膜中HIF-1αmRNA的表達(dá)在RIRI后，HIF-1α mRNA表達(dá)迅速增加，在再灌注后12 h達(dá)到高峰，一直持續(xù)到再灌注后48 h表達(dá)量仍較高。與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，提前給予雷帕霉素(2 mg·kg-1)能夠明顯抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)，2組再灌注后0 h、6 h、12 h、24 h及48 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05，見表3)。

Figure 2 Retinal TUNEL staining at 24 hours after reperfusion (×400).A:Blank control group;B:Experimental control group at 24 hours after reperfusion;C:Experimental group at 24 hours after reperfusion 大鼠再灌注后24 h視網(wǎng)膜TUNEL染色圖像(×400)。A：空白對(duì)照組；B：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組再灌注后24 h；C：實(shí)驗(yàn)組再灌注后24 h

表3 視網(wǎng)膜缺血再灌注后不同時(shí)間HIF-1α mRNA表達(dá)變化Table 3 Comparison of HIF-1α mRNA expression at different time points after reperfusion between experimental group and experimental control group(±s，n=5)

3 討論

RIRI可引起自由基、刺激性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等[5]，導(dǎo)致RGC及內(nèi)核層細(xì)胞的凋亡。已有研究觀察到升高眼壓可引起大鼠RIRI模型中超微形態(tài)學(xué)變化，表明RGC層和內(nèi)核層中存在細(xì)胞凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用TUNEL法觀察RIRI細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況，再灌注后6 h可見視網(wǎng)膜中出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，大多位于RGC層；再灌注后12 h視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡開始增多，24 h后凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)達(dá)頂峰，多見于RGC層和內(nèi)核層；48 h后凋亡細(xì)胞陽性染色開始減少，主要見于RGC層；這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[7]。因此，抑制RGC的凋亡、促進(jìn)RGC的存活是RIRI發(fā)生后要解決的關(guān)鍵問題。本實(shí)驗(yàn)也表明，RIRI后大鼠RGC大量丟失。

HIF-1是低氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1由 HIF-1α和HIF-1β兩亞單位組成，HIF-1的調(diào)節(jié)受到多種因素的影響，HIF-1的穩(wěn)定和活性主要是由 HIF-1α決定的，且HIF-1α是專一受氧調(diào)節(jié)的亞基，調(diào)控著下游眾多基因，其靶基因主要包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)、糖酵解酶、環(huán)氧合酶(cyclooxygenasa，COX)，影響細(xì)胞凋亡因子p53等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[8]，HIF-1調(diào)控的基因以不同的方式參與細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)過程，從而增加了細(xì)胞在缺氧環(huán)境下的生存能力。視網(wǎng)膜細(xì)胞代謝的最大特點(diǎn)是耗氧量大，對(duì)缺氧特別敏感，在正常氧條件下，HIF-1α在視網(wǎng)膜中表達(dá)極低。Kaur等[9]觀察發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜缺氧之后，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)增加。此外，HIF-1還參與熱休克蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)缺氧可明顯增加大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)中細(xì)胞HIF-1蛋白的表達(dá)[10]，并調(diào)控其下游基因p53的表達(dá)，缺氧是p53最強(qiáng)的生理性誘導(dǎo)劑，在缺氧情況下，去磷酸化的HIF-1α通過與p53結(jié)合介導(dǎo)缺氧情況下p53依賴的凋亡。HIF-1和p53在缺氧誘導(dǎo)性的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中起著關(guān)鍵作用，兩者共同控制著缺氧誘導(dǎo)性神經(jīng)元死亡[11]，HIF-1α在缺血性視網(wǎng)膜病變中對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞可能起著相似的作用。袁海虹等[12]在大鼠RIRI模型研究中采用免疫組織化學(xué)及RT-PCR發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的表達(dá)增加與損傷后的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，推測(cè)其表達(dá)可能與視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系。最近新的研究證明，以HIF-1α作為靶點(diǎn)治療缺氧性視網(wǎng)膜疾病取得了相應(yīng)的成果[13]。本實(shí)驗(yàn)通過建立RIRI的模型初步證明，雷帕霉素發(fā)揮抗凋亡作用是通過減少HIF-1α表達(dá)來完成的。

雷帕霉素是20世紀(jì)70年代初由加拿大Ayerst研究所從放線菌培養(yǎng)液中分離出來的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。雷帕霉素有特異性抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的作用[14]。mTOR是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與多種生理及病理過程，其通過調(diào)控多種靶向分子達(dá)到促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用，主要靶向點(diǎn)在翻譯及轉(zhuǎn)錄這兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長、增殖及分化、凋亡的調(diào)控[15-18]。mTOR 下游靶點(diǎn)p70S6K 及4E-BP1 均與蛋白合成速率密切相關(guān)，提示mTOR 可能影響應(yīng)激下的蛋白合成。由于神經(jīng)修復(fù)過程中神經(jīng)細(xì)胞存活與正常蛋白合成速率有關(guān)，mTOR可感受細(xì)胞外應(yīng)激，從而通過補(bǔ)償減少的蛋白合成來參與神經(jīng)修復(fù)機(jī)制。由于mTOR自噬的負(fù)性調(diào)控，抑制mTOR信號(hào)通路后會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡[19]。Srinivas等[20]假設(shè)自噬是由AMPK及mTOR的活化調(diào)節(jié)的，并且是依賴于HIF-1α的方式，并提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。雷帕霉素可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活化和抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，使細(xì)胞停止增殖并最終凋亡。Zhao等[21]研究表明，通過減弱mTOR介導(dǎo)的應(yīng)激性視網(wǎng)膜色素細(xì)胞功能缺失，雷帕霉素提高和促進(jìn)了視網(wǎng)膜退行性疾病模型中光感受器數(shù)量及功能。Chen等[3]通過建立大鼠腦缺氧缺血模型，證實(shí)腹腔注射雷帕霉素可以阻斷mTOR信號(hào)通路，調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF表達(dá)來抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。mTOR信號(hào)通路可能通過影響HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞自噬等生物過程。

本實(shí)驗(yàn)選擇雷帕霉素作用于RIRI模型，HE染色法觀察RGC形態(tài)，TUENL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況及PCR法測(cè)定HIF-1α mRNA的表達(dá)，依此來研究雷帕霉素對(duì)RIRI后RGC存活的影響，并初步探討產(chǎn)生這一作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組RIRI后0 h即可見視網(wǎng)膜組織水腫、疏松，24 h時(shí)可見視網(wǎng)膜有明顯的病理改變。而實(shí)驗(yàn)組中再灌注后0 h視網(wǎng)膜水腫明顯減輕，TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少。另外，從Real time-PCR檢測(cè)結(jié)果中可見，RIRI后大鼠HIF-1α mRNA表達(dá)增加，雷帕霉素能夠通過抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)而促進(jìn)RGC的存活。

綜上所述，雷帕霉素對(duì)RIRI具有保護(hù)作用，可能與其下調(diào)HIF-1α mRNA表達(dá)及抗凋亡作用相關(guān)。但因RIRI后細(xì)胞凋亡反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，而雷帕霉素能通過多條途徑抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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date：Jan 16，2014

Natural Science Foundation of Guangxi(No:2010GXNSFA013140)From theDepartmentofOphthalmology，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，GuangxiZhuangAutonomousRegion，China

Protective effects of raamycin on retinal ischemia-reperfusion injury of rats

ZHAO Kun，HUANG Min-Li，WANG Miao，LIU Xin

rapamycin;wistar rat;hypoxia-inducible factor 1α；retinal ischemia-reperfusion injury;cell apoptosis

Objective To study the protective effects and its mechanism of rapamycin (RAPA) on retinal ischemia-reperfusion injury (RIRI) of rat.Methods Seventy-five SPF healthy male rats were random divided into three groups:blank control group，experimental control group and experimental group，25 rats in each group.RIRI models were induced in experimental control group and experimental group by increasing intraocular pressure via an intracameral catheter.The rats in experimental group underwent the intraperitoneal injection with PAPA (2 mg·kg-1) 2 hours before retinal ischemia，and the experimental control group with normal sodium and DMSO.The retinal specimens of three groups were taken at 0 hour，6 hours，12 hours，24 hours and 48 hours after reperfusion.The morphology of retinal ganglion cells (RGC) and inner retinal layer thickness were observed or measured by HE staining，TUNEL technique was used to examine the apoptosis of RGC，and the level of hypoxia-inducible factor 1α mRNA in retinal tissue was analyzed by real-time PCR assay.Results At 0 hour after reperfusion，the inner retinal layer thickness in experimental group and experimental control group were (137.55±7.76)μm and (162.26±6.41)μm，the retinal edema in experimental group was less than that in experimental control group，and the vacuolar phenomenon of RGC was also less.At 6 hours later after reperfusion，the inner retinal layer thickness of experimental group were greater than that of experimental control group (allP<0.05).At 12 hours，24 hours and 48 hours after reperfusion，the apoptotic cells in experimental group were obvious less than those in experimental control group (allP<0.05).The expressions of hypoxia-inducible factor 1α mRNA at 0 hour，6 hours，12 hours，24 hours and 48 hours after reperfusion in experimental group were obvious lower than those in experimental control group (allP<0.05).Conclusion RAPA can protect the retina against RIRI，and the down-regulation of hypoxia-inducible factor 1α may be involved in the mechanism of the protection.

趙昆，男，1987年8月出生，在讀碩士研究生。研究方向：玻璃體視網(wǎng)膜疾病及復(fù)雜性眼外傷。聯(lián)系電話：18776169642；E-mail:zhaokun870624@126.com

AboutZHAOKun：Male，born in August，1987.Postgraduate student.Research direction:Vitreoretinal diseases and ocular trauma.Tel:18776169642；E-mail:zhaokun870624@126.com

2014-01-16

廣西自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：2010GXNSFA013140)

530021 廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科

黃敏麗， E-mail：nnhml@163.com

趙昆,黃敏麗,王淼,劉欣.雷帕霉素對(duì)視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[J].眼科新進(jìn)展,2014,34(5):409-413.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0113

修回日期：2014-02-20

本文編輯：方紅玲

Accepteddate:Feb 20，2014

Responsibleauthor:HUANG Min-Li，E-mail：nnhml@163.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(5)：409-413]