暢立斌 劉鵬飛 金恩忠 陳思 肖林

VIPhybrid對長波長紅光誘導近視化作用的影響

暢立斌 劉鵬飛 金恩忠 陳思 肖林

長波長光；近視；血管活性腸肽；鞏膜

目的觀察VIPhybrid(一種非特異性血管活性腸肽拮抗劑)對紅光誘導的近視眼生長發(fā)育的影響，并探討鞏膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和組織金屬蛋白酶抑制因子-2(tissue in-hibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表達的變化，揭示紅光誘導近視形成的可能蛋白通路。方法建立長波長紅光誘導的近視模型。將36只豚鼠隨機分為3組，前2組右眼分別給予高(A組)、低(B組)濃度VIPhybrid玻璃體內(nèi)注射飼養(yǎng)在紅光中，后一組右眼高濃度VIPhybrid注射在白光中飼養(yǎng)為對照組(C組)。觀測3組豚鼠眼球生物學指標、鞏膜形態(tài)改變、視網(wǎng)膜血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)以及鞏膜組織中MMP-2/TIMP-2表達情況。結(jié)果實驗4周后組間比較，紅光明顯誘導豚鼠眼軸變長，A組左眼眼軸長度為(8.10±0.09)mm、B組左眼為(8.13±0.08)mm，明顯長于C組左眼的(7.78±0.07)mm(P<0.05)；A組右眼眼軸長度為(7.85±0.09)mm，B組右眼為(8.01±0.07)mm，B組抑制眼軸增長的幅度低于A組(P<0.05)，A組、B組右眼眼軸明顯短于左眼(均為P<0.05)，但仍長于C組(7.76±0.08)mm。A組右眼后鞏膜干質(zhì)量相對較重，視網(wǎng)膜VIP表達明顯抑制，后鞏膜MMP-2表達降低，TIMP-2表達增高(均為P<0.05)；B組豚鼠右眼亦發(fā)生上述相同變化，但各指標變化幅度均低于A組(均為P<0.05)；另外與C組相比，A、B組后鞏膜干質(zhì)量、視網(wǎng)膜VIP及鞏膜TIMP-2的表達均低于C組，而鞏膜MMP-2表達高于C組(均為P<0.05)。結(jié)論VIP參與紅光誘導的豚鼠近視化作用，阻斷VIP可部分延緩近視發(fā)展，且有濃度依賴關(guān)系。

[眼科新進展，2014，34(5)：428-432]

目前許多研究模擬各種光照環(huán)境，探討動物眼球生長發(fā)育的變化。已證實長波長紅光能夠促進眼軸延長，導致近視發(fā)生[1-3]，但其誘導近視發(fā)生的具體機制尚未明確。血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide， VIP)是一類具有神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)功能的生物活性肽，作為視覺分子在視覺誘導近視眼形成的過程中起到視覺信息傳遞與調(diào)控的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，長波長紅光照射下豚鼠視網(wǎng)膜VIP表達明顯上調(diào)，提示VIP 可能參與紅光誘導的近視化過程中[4]。為進一步證實VIP在近視中的作用，本研究選擇VIPhybrid(一種非特異性VIP拮抗劑)作為干預劑，觀察其對紅光誘導的近視眼生長發(fā)育的影響，并探討鞏膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和組織金屬蛋白酶抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表達的變化，揭示紅光誘導近視形成的可能蛋白通路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組1周齡英國種短毛三色豚鼠36只，均為雄鼠，體質(zhì)量100～150 g。應用隨機數(shù)字法將豚鼠隨機分為A、B、C 3組，每組12只。正常飼養(yǎng)1周后再進行實驗。A組豚鼠右眼玻璃體內(nèi)注射高濃度VIPhybrid(30×10-9mol·L-1，溶劑為無菌生理鹽水)10 μL，左眼玻璃體內(nèi)注射無菌生理鹽水10 μL為對照，排除生理鹽水的影響；B組豚鼠右眼玻璃體內(nèi)注射低濃度VIPhybrid(0.3×10-9mol·L-1，溶劑為無菌生理鹽水)10 μL，左眼不予任何藥物注射，作對照眼；C組豚鼠右眼給予10 μL高濃度VIPhybrid(30×10-9mol·L-1，溶劑為無菌生理鹽水)玻璃體內(nèi)注射，左眼不予任何處置，為正常對照組。其中A組、B組豚鼠飼養(yǎng)在長波長紅光環(huán)境中(610 nm)；C組處于白光環(huán)境中(廣譜波長，色溫5000 K)。該拮抗劑濃度是根據(jù)Seltner等[5]及王平寶等[6]的研究及試劑說明書所選擇的，定義30×10-9mol·L-1為較高濃度，0.3×10-9mol·L-1為較低濃度。實驗動物由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。實驗動物所有處置均通過北京世紀壇醫(yī)院倫理委員會的審核。

1.1.2主要試劑及儀器SP-9001試劑盒(過氧化物酶標記鏈卵白素染色試劑盒)、山羊抗兔生物素化二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠VIP IgG多克隆一抗(Abcam)；DAB顯色試劑盒(上海藍基生物技術(shù)有限公司)；β-actin兔抗鼠多克隆一抗、MMP-2兔抗鼠多克隆一抗 (武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；IRDye700cw熒光標記羊抗兔IgG二抗(Rockland)；豚鼠金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-2)ELISA 試劑盒(上海越研生物技術(shù)有限公司)；VIPhybrid干粉(Sigma-Aldrich Co.LLC.美國)。

1.2實驗方法

1.2.1玻璃體內(nèi)注射VIPhybrid100 g·L-1水合氯醛按3 mL·kg-1體質(zhì)量作腹腔注射麻醉；復方托吡卡胺眼液滴雙眼充分散大瞳孔；將豚鼠固定在體式顯微鏡下，充分暴露眼球；玻璃體內(nèi)注射前先用15°側(cè)切口于600方位角膜緣行前方穿刺，放出少量房水；用10 μL微量注射器抽取10 μL各組藥物，顯微鏡下距背側(cè)角膜緣后約1 mm處刺入玻璃體內(nèi)，緩慢注入藥物，停留15 s左右拔針。雙眼注射。術(shù)后涂金霉素眼膏，注射時間為每天1400時(近光照周期中點)，共持續(xù)4周。

1.2.2光照模型的建立設置3個100 cm×80 cm×60 cm大小的木箱，內(nèi)面均附以錫紙，側(cè)面各有若干通氣口，頂面安置二極管發(fā)光系統(tǒng)。兩個為紅光照射(波長610 nm，半峰值帶寬為20 nm)，一個為白光照射。將豚鼠籠具放入3個木箱中，調(diào)整燈管數(shù)量、燈管與籠具的距離，使各籠具底面水平光照度達200 lux。光照周期均為12/12 h(光照時間：8 am-8 pm)，持續(xù)4周[7-8]。

1.2.3眼軸測量在實驗0周及4周時進行測量。動物眼A超測量儀手動模式下將探頭垂直于角膜平面，對準瞳孔中心，測量豚鼠眼軸長度(axial length， AL)，測量10次取平均值。

1.2.4后鞏膜干質(zhì)量的測量實驗4周后各組隨機取4只豚鼠給予100 g·L-1水合氯醛3 mL·kg-1麻醉。處死后迅速取出眼球，用6 mm顯微角膜環(huán)鉆鉆取鼻側(cè)后極部鞏膜(距視神經(jīng)根部1 mm)，分離視網(wǎng)膜脈絡膜組織，將鞏膜組織放入烤箱中，105 ℃烘烤24 h，用電子稱稱質(zhì)量，得到鞏膜干質(zhì)量。

1.2.5免疫組織化學法檢測視網(wǎng)膜VIP的表達將分離出的視網(wǎng)膜組織固定后常規(guī)梯度脫水，透明，石蠟包埋，制作連續(xù)切片 10 張，每張切片厚度約 4 μm。10 張切片中 2 張進行常規(guī) HE 染色，2張用于對照。其余 6 張進行免疫組織化學染色(SP三步法)。主要步驟按試劑盒說明書操作，一抗?jié)舛葹?1500，光學顯微鏡下攝像分析(高倍視野×400)，計算每張切片高倍鏡下陽性細胞數(shù)目，以平均值記錄。并采用Cmias4.0病理圖像分析系統(tǒng)軟件對切片VIP 陽性信號進行圖像分析，表達強度用積分光密度(IOD)值表示。PBS緩沖液作為陰性對照，陽性對照取豚鼠小腸石蠟切片。

1.2.6Westernblot法檢測鞏膜組織中MMP-2的表達實驗結(jié)束后，各組隨機取5只豚鼠檢測MMP-2的表達。將后部鞏膜迅速放入液氮中后轉(zhuǎn)入-80 ℃凍存。待樣本收集完全后提取蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加兔抗鼠MMP-2(1100)，4 ℃過夜。洗膜后加IRDye700cw熒光標記羊抗兔IgG二抗(110 000)，采用LICOR Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影。

1.2.7ELISA法檢測TIMP-2的表達組織蛋白提取同前，按照豚鼠TIMP-2 ELISA試劑盒說明書進行操作，根據(jù)標準品的濃度及對應的吸光度(OD)值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度檢測鞏膜中TIMP-2的表達。

1.3統(tǒng)計學分析本研究統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件包。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差的形式記錄。各組間數(shù)據(jù)比較：正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布資料采用q檢驗；不同時間點組內(nèi)比較采用重復測量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠AL的變化 實驗前各組豚鼠左右眼AL差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05，見表1)。4周后右眼AL組間相比：C組

表1 實驗前后各組豚鼠AL變化Table 1 AL changes of guinea pigs before and after experiment in each group(±s，l/mm)

2.2各組豚鼠后鞏膜干質(zhì)量的比較右眼后鞏膜干質(zhì)量組間相比：C組>A組>B組，差異有統(tǒng)計學意義(F=38.294，P=0.000，見表2)；左眼后鞏膜干質(zhì)量組間相比，A組、B組明顯低于C組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=22.966，P=0.000)，A 組與B組左眼后鞏膜干質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.342)。各組豚鼠左右眼比較發(fā)現(xiàn)：A組和B組豚鼠兩眼間均存在顯著差異，右眼后鞏膜干質(zhì)量明顯高于左眼(均為P=0.000)；C組豚鼠兩眼間后鞏膜干質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.163；見表2)。

表2 實驗4周后各組豚鼠后鞏膜干質(zhì)量比較Table 2 Dry weight of posterior scleral of guinea pigs after 4 weeks in each group

2.3視網(wǎng)膜VIP表達的比較免疫組織化學顯示在豚鼠視網(wǎng)膜中VIP在細胞胞漿中表達，呈棕黃、棕色顆粒狀。VIP強表達部位主要位于內(nèi)叢狀層(雙極細胞、無長突細胞與神經(jīng)節(jié)細胞相互接觸形成突觸的部位)、神經(jīng)節(jié)細胞層以及內(nèi)核層(雙極細胞、無長突細胞、水平細胞的細胞核組成)，在光感受器細胞層亦有表達(圖1)。右眼視網(wǎng)膜VIP陽性細胞計數(shù)組間相比：A組0.05；見表3)。

表3 實驗4周后各組豚鼠視網(wǎng)膜VIP陽性細胞數(shù)Table 3 Number of VIP positive cells of guinea pigs after 4 weeks in each group

2.4后鞏膜組織MMP-2表達的比較以C組豚鼠左眼活化MMP-2表達OD值為參照，即100.0%±4.0%，各組左右眼相比發(fā)現(xiàn)：A組和B組豚鼠兩眼間均存在顯著差異，右眼后鞏膜組織活化MMP-2表達量明顯低于左眼(t=20.366、-13.043，均為P=0.000)；C組豚鼠兩眼間后鞏膜組織活化MMP-2表達差異無統(tǒng)計學意義(t=1.823，P=0.098；見表4)。

表4 實驗4周后各組豚鼠后鞏膜MMP-2表達值OD值Table 4 OD values of MMP-2 expression in posterior scleral of guinea pigs after 4 weeks in each group

2.5后鞏膜組織TIMP-2的表達比較

2.5.1繪制標準曲線ELISA法檢測TIMP-2的表達線性范圍限制在4.0～80.0 μg·L-1。以空白孔調(diào)零，各標準品吸光度(y)值對標準品濃度(x)作線性回歸的方程式為：y=0.037x+0.111(R2=0.990 1，P>0.05)。

2.5.2各組豚鼠眼球后鞏膜組織TIMP-2的含量

2.5.2.1右眼后鞏膜組織TIMP-2的表達實驗4周，A、B、C三組豚鼠右眼后鞏膜TIMP-2的含量分別為：(67.10±6.67)μg·L-1、(55.12±7.28)μg·L-1、(76.53±8.66)μg·L-1。三組豚鼠右眼組間比較發(fā)現(xiàn)，C組高于A組、B組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=12.864，P=0.001)。

Figure 1 Expression of VIP in retina of guinea pigs at 4 weeks after VIPhybrid injection (×400).A1：Right eye in group A;A2:Left eye in group A;B1：Right eye in group B;B2:Left eye in group B;C1：Right eye in group C;C2:Left eye in group C VIPhybrid注射4周后豚鼠視網(wǎng)膜VIP表達情況(×400 )。A1：A組右眼；A2：A組左眼；B1：B組右眼；B2：B組左眼；C1：C組右眼；C2：C組左眼

2.5.2.2左眼后鞏膜組織TIMP-2的表達實驗4周，A、B、C三組豚鼠左眼后鞏膜TIMP-2的含量分別為：(40.09±4.57)μg·L-1、(43.01±4.18)μg·L-1、(73.86±5.30)μg·L-1。A組、B組豚鼠左眼TIMP-2表達均低于C組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=26.855，P=0.000)；A組、B組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.336)。

各組豚鼠左右眼比較：A組、B組豚鼠右眼TIMP-2的表達均明顯高于同組左眼，差異有顯著統(tǒng)計學意義(q=11.043、7.563，均為P=0.000)；C組豚鼠兩眼間TIMP-2表達差異無統(tǒng)計學意義(q=-0.602，P=0.000)。

3 討論

VIP屬于小分子生物活性肽，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。既往研究證實視網(wǎng)膜細胞群中廣泛表達VIP參與多種視覺信號通路的調(diào)控，是功能性視網(wǎng)膜發(fā)育分化的促進因子。Seltner等[5]建立雛雞單眼形覺剝奪性近視模型，發(fā)現(xiàn)玻璃體內(nèi)注射VIP拮抗劑能完全消除形覺剝奪性近視的發(fā)生。前期研究發(fā)現(xiàn)長波長紅光環(huán)境中豚鼠視網(wǎng)膜VIP 表達明顯上升，且與后部鞏膜干質(zhì)量呈顯著負相關(guān)[4]。提示VIP可能在視網(wǎng)膜水平對近視眼后部鞏膜的主動重塑起重要調(diào)控作用。

VIP的生物學效應通過與其受體結(jié)合實現(xiàn)的，VIP受體(VIP-R)共分為三類：VPAC1受體，與腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)偶聯(lián)；VPAC2受體，與腺苷酸環(huán)化酶和鈣-氯通道偶聯(lián)；PAC1受體，與腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶C偶聯(lián)[9]。VIP-R廣泛表達于視網(wǎng)膜內(nèi)網(wǎng)狀層的無長突細胞，其次是雙極細胞和神經(jīng)節(jié)細胞，以VPAC2受體為主，其次為VPAC1受體。VIPhybrid為非選擇性VIP受體拮抗劑，是血管緊張素(Ang)與VIP氨基酸片段的雜合物，即血管緊張素(6-11)-VIP(7-28)[10-11]。該物質(zhì)可以非選擇性同時作用于VPAC1和VPAC2兩種受體，競爭性抑制VIP與這兩種受體的結(jié)合，拮抗VIP的生理作用[12]。這也是本研究選擇VIPhybrid的依據(jù)。本實驗結(jié)果顯示，紅光照射明顯誘導豚鼠AL增長，對應豚鼠視網(wǎng)膜VIP高表達，選用不同濃度VIPhybrid進行玻璃體內(nèi)注射可抑制VIP表達，一定程度抑制紅光照射引起的眼球生長發(fā)育，進一步證明了VIP高表達與軸性近視的關(guān)系。VIP抑制長波長紅光誘導的近視化過程，且呈濃度依賴關(guān)系(高濃度VIPhybrid抑制作用更為明顯)。但與白光照射豚鼠相比，仍表現(xiàn)為近視化狀態(tài)，即不能完全消除近視化過程。

既往研究證實鞏膜是近視發(fā)生機制的最終靶器官，尤其是后極部鞏膜細胞外基質(zhì)重塑與病理性近視的發(fā)生密切相關(guān)[13-14]。本實驗中也比較各組后鞏膜干質(zhì)量的變化，以白光照射條件下豚鼠鞏膜干質(zhì)量為參照，發(fā)現(xiàn)紅光使豚鼠后部鞏膜變薄，干質(zhì)量減輕；玻璃體內(nèi)注射VIPhybrid后能部分抑制鞏膜的重塑變薄，抑制程度呈劑量依賴性。提示拮抗VIP的作用可以抑制后部鞏膜的重塑變薄，延緩眼軸的延長、近視發(fā)展。

鞏膜主要由大量的膠原纖維和彈性纖維組成，調(diào)節(jié)膠原纖維、基質(zhì)合成與降解最關(guān)鍵的一類蛋白酶為MMP-2及TIMP-2間的動態(tài)平衡。許多研究報道MMP-2/TIMP-2參與形覺剝奪性及透鏡誘導性近視的發(fā)生[15-16]。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅光抑制豚鼠鞏膜TIMP-2表達，導致MMP-2表達增高，玻璃體內(nèi)注射VIPhybrid后能部分調(diào)控鞏膜MMP-2/TIMP-2表達，TIMP-2表達增高，MMP-2表達下調(diào)，抑制程度呈劑量依賴性。但鞏膜中MMP-2/TIMP-2表達變化與視網(wǎng)膜VIP表達不一致。說明VIPhybrid能有效拮抗視網(wǎng)膜VIP的表達；同時鞏膜MMP-2/TIMP-2表達平衡除受到視網(wǎng)膜VIP表達的影響外，還由其他多種可能的生物活性物質(zhì)調(diào)控。上述實驗結(jié)果提示，VIPhybrid抑制視網(wǎng)膜VIP表達后，一定程度下調(diào)鞏膜MMP-2表達，伴TIMP-2表達上調(diào)，進而抑制后鞏膜重塑變薄及眼軸的延長，延緩近視化過程。

另外本研究比較了各組豚鼠左右眼及不同組豚鼠非注射眼間各指標的差異，發(fā)現(xiàn)白光環(huán)境下高濃度VIPhybrid注射沒有影響豚鼠眼球的生長發(fā)育及后極部組織VIP、MMP-2/TIMP-2的表達。說明VIPhybrid對正常環(huán)境下眼球生長及屈光發(fā)育無明顯影響，但可以延緩長波長紅光誘導眼球近視的進展。

綜上所述，VIPhybrid能夠一定程度地抑制鞏膜組織MMP-2表達，伴 TIMP-2表達上調(diào)，鞏膜細胞外基質(zhì)重塑過程受阻，抑制眼軸的延長，繼而長波長光誘導的近視化過程延緩，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。提示視網(wǎng)膜VIP-鞏膜MMP-2/TIMP-2可能是長波長紅光誘導近視化過程的一條蛋白通路。但是研究中存在一些未明確的地方：包括視網(wǎng)膜VIP與鞏膜MMP-2之間的具體分子信號通路；其他神經(jīng)遞質(zhì)與VIP、MMP-2在近視化過程中的相互聯(lián)系；以及該拮抗劑對白光環(huán)境中眼球生長無明顯影響的原因都有待于研究。

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date：Aug 13，2013

Effects of VIPhybrid on long wave red light induced myopia

CHANG Li-Bin，LIU Peng-Fei，JIN En-Zhong，CHEN Si，XIAO-Lin

long wave-length light;myopia;vasoactive intestinal polypeptide;sclera

Objective To observe the effects of a non-specific vasoactive intestinal polypeptide (VIP) receptor antagonist (VIPhybrid) on progression of long wavelength red light induced myopia in guinea pigs，and investigate the expression changes of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) in sclera tissues，and find the possible protein pathway of myopia formation induced by red light.Methods Myopia models induced by long wave red light were established.Thirty-six guinea pigs were divided into three groups，the cases in group A and group B were intravitreal injected VIPhybrid with high and low concentrations into right eyes and bred in red light，the cases in group C were intravitreal injected VIPhybrid with high concentrations into right eyes and bred in white light.The ocular bioparameters and posterior scleral morphous were observed，and the expression of retinal VIP，scleral MMP-2/TIMP-2 were detected.Results After 4 weeks of VIPhybrid injection，the red light could induce the long ocular axis，the ocular axis of left eye in group A，B，C were (8.10±0.09)mm，(8.13±0.08)mm and (7.78±0.07)mm，respectively，group A and B were longer than group C (allP<0.05).The ocular axis of right eye in group A，B and C were (7.85±0.09)mm，(8.01±0.07)mm and (7.76±0.08)mm，respectively，there was statistical difference between group A and B (P<0.05)，group A and B were longer than group C (bothP<0.05).In group A，the posterior scleral dry weight was relatively high，the expression of VIP was decreased，and the expression of MMP-2 was also decreased，the expression of TIMP-2 was increased.In group B，the changes were same as above in group A，but lighter than group A (bothP<0.05).The posterior scleral dry weight and expression of VIP and TIMP-2 in group A and B were lower than those in group C，and the expression of MMP-2 was higher than group C (bothP<0.05).Conclusion VIP plays a role in the red light induced myopia of the guinea pigs，VIPhybrid can alleviate the myopia partly，and the inhibiting effect is positively related with reagent concentration.

暢立斌，男，1982年10月出生。聯(lián)系電話：010-63926275；E-mail：mdchang@yeah.net

AboutCHANGLi-Bin：Male，born in October，1982.Tel:+86-10-63926275;E-mail:mdchang@yeah.net

2013-08-13

100038 北京市， 首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院

肖林， E-mail:xiaolin1957@126.com

暢立斌,劉鵬飛,金恩忠,陳思,肖林.VIPhybrid對長波長紅光誘導近視化作用的影響[J].眼科新進展,2014,34(5):428-432.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0117

修回日期：2014-01-06

本文編輯：方紅玲

Accepteddate:Jan 6，2014

From theDepartmentofOphthalmology，BeijingShijitanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100038，China

Responsibleauthor:XIAO Lin，E-mail：xiaolin1957@126.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(5)：428-432]