韓 豪，李新生，江 海，石紹福，馬嬌燕，楊智勇，劉水英，王 昕

（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中 723000;2.陜西省黑色有機食品工程技術研究中心，陜西漢中 723000;3.陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723000;4.運城學院生命科學系，陜西漢中 723000）

花青苷類物質(zhì)又名花色苷，是在自然狀態(tài)下花青素與各種單糖結(jié)合而成的黃酮多酚類化合物。常見的花青苷類物質(zhì)主要有天竺葵素（花葵素）、矢車菊素、飛燕草素（翠雀素）、芍藥素、矮牽牛素和錦葵素六大類［1－6］。黑米的種皮中富含花青苷類物質(zhì)，具有清除自由基、抗氧化、抑制酶活性、保護血管、抗炎癥和抑制腫瘤等多種功效［7－9］。

目前國內(nèi)外對黑米花青苷的報道多集中在花青苷的提取和穩(wěn)定性研究上，而對黑米花青苷單一組分分析的研究較少，在之前的研究中僅對黑米中的矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷和芍藥素－3－葡萄糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷和錦葵素－3－半乳糖苷進行了準確定性［7，10］。因此，本研究采用超高效液相色譜－三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC－MS/MS），建立矢車菊素類、芍藥素類、天竺葵素類和錦葵素類這四類共13種花青苷類物質(zhì)的定性方法，并對黑米（黑帥）中這13種花青苷類物質(zhì)進行了定性分析。從而為黑米花青苷類化合物單一組分的系統(tǒng)分析、分離純化和藥理活性研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑米樣品 黑帥，由陜西省水稻研究所提供。

乙腈、甲醇 色譜純，霍尼韋爾公司;甲酸 色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司;13種標準品 均購置于sigma公司，含量均≥97%，分別為矢車菊素（Cy）、矢車菊素－3－葡萄糖苷（Cy－3－glc），矢車菊素－3－阿拉伯糖苷（Cy－3－ara），矢車菊素－3－蕓香糖苷（Cy－3－rut），矢車菊素－3－槐糖苷（Cy－3－soph）;天竺葵素－3－葡萄糖苷（Pg－3－glc）;錦葵素－3－葡萄糖苷（Mv－3－glc）、錦葵素－3－半乳糖苷（Mv－3－gal）;芍藥素（Pn）、芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷（Pn－3，5－diglc）、芍藥素－3－半乳糖苷（Pn－3－gal）、芍藥素－3－葡萄糖苷（Pn－3－glc）、芍藥素－3－阿拉伯糖苷（Pn－3－ara）。

ACQUITY TQD超高效液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國waters公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DZF6050真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;LC－800離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司。

1.2 樣品處理

準確稱取黑米（黑帥）1.0g，加入100mL石油醚索氏提取兩次，提取時間均為3h。樣品揮干后，加入100mL乙酸乙酯，置于60℃水浴中至乙酸乙酯揮干，重復操作一次。然后加入6%的甲酸水溶液50mL，在50℃下回流提取6h，重復操作一次，合并上清液，用6%甲酸水溶液定容至100mL，再用0.2μm的針頭過濾器過濾，于超高效液相－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3 質(zhì)譜方法的建立

離子源:電噴霧離子源（ESI）;檢測模式:多反應監(jiān)測;掃描方式:正離子掃描;脫溶劑氣流量:800L/h;錐孔氣流量:50L/h;毛細管電壓:3kV;離子源溫度:110℃;脫溶劑氣溫度:400℃。

1.4 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）;流速 0.3mL/min;柱溫 40℃;進樣量:10μL。流動相A為乙腈，B為0.6%甲酸水溶液，進行梯度洗脫，梯度洗脫參數(shù)如表1所示。

表1 超高效液相色譜條件Table 1 Gradient elution procedure for UPLC seperation

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將表2中的13種花青苷類物質(zhì)標準品用6%的甲酸水溶液溶解后，配制成500～1000μg/mL的標準溶液，然后以直接進樣方式分別注入離子源中，在ESI正離子模式下進行母離子全掃描，得到每種花青苷類物質(zhì)的分子離子峰，以每種花青苷類物質(zhì)的準分子離子峰為母離子，進行二級質(zhì)譜掃描，接著采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，對每種花青苷類物質(zhì)的二級質(zhì)譜參數(shù)如錐孔電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化，最后每種花青苷類物質(zhì)的定性離子產(chǎn)生的離子對強度比例達到最大時為最佳，得到以定性離子、錐孔電壓和碰撞電壓的相關數(shù)據(jù)，如表2所示。

表2 花青苷標準品最佳錐孔電壓和碰撞電壓Table 2 The best cone voltages and collision voltages of anthocyanins standard solution

花青苷類物質(zhì)是由花青苷苷元與一個或多個糖分子通過糖苷鍵結(jié)合的化合物，其種類繁多，存在多個同分異構(gòu)體，且極性相近，因此純化和檢測難度較大［2］。目前國內(nèi)外采用液質(zhì)聯(lián)用法對花青苷進行定性分析時，多采用在同一錐孔和碰撞電壓下檢測化合物的特征離子對，并參考該化合物紫外最大吸收波長［10－11］，但是從表 2 中可見，花青苷類化合物最佳的錐孔和碰撞電壓差異顯著，用同一電壓進行二級質(zhì)譜碰撞時，部分化合物會因電壓過大，使得特征子離子被電離成碎片離子，或者因電壓過小，無法電離，從而無法檢測出特征子離子。本實驗采用直接進樣方式將標準溶液依次注入離子源中，對每種化合物的錐孔和碰撞電壓進行優(yōu)化，提高了樣品檢測的靈敏度和準確性。

在適當?shù)腻F孔電壓和碰撞電壓下，花青苷的糖苷鍵首先斷裂，之后花青苷苷元C環(huán)開環(huán)重排。矢車菊素類花青苷的糖苷鍵斷裂后會檢測到m/z 287的特征離子峰，即為矢車菊素類花青苷苷元，加大碰撞電壓，可得到m/z 136.9的特征碎片離子峰，即為原兒茶醛（3，4－二羥基苯甲醛）。例如，矢車菊素－3－葡萄糖苷在錐孔電壓為32V，碰撞電壓為22V時，矢車菊素－3－葡萄糖苷（m/z 449.1）的葡萄糖苷鍵斷裂，得到矢車菊素花青苷苷元（m/z 287）和葡萄糖（m/z 162），而葡萄糖不帶電荷在質(zhì)譜中無法檢測出;之后在錐孔電壓為32V，碰撞電壓為56V時，矢車菊素花青苷苷元（m/z 287）C環(huán)開環(huán)重排，得到特征子離子為原兒茶醛（m/z 136.9），因此，矢車菊素－3－葡萄糖苷特征定性離子對應為449.1/287和449.1/136.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見圖1（A）所示。

芍藥素類花青苷的糖苷健斷裂后會檢測到m/z 301的特征離子峰，即為芍藥素類花青苷苷元;加大碰撞電壓，可得到m/z 150.9的特征碎片離子峰，即為香草醛（3－甲氧基－4－羥基苯甲醛）。以芍藥素－3－半乳糖苷（m/z 463）為例，芍藥素－3－半乳糖苷特征定性離子對應為463/301和463/150.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見圖1（B）所示。

錦葵素類花青苷的糖苷健斷裂后會檢測到m/z 331的特征離子峰，即為錦葵素類花青苷苷元;加大碰撞電壓，可得到m/z 180.9的特征碎片離子峰，即為丁香醛（3，5－二甲氧基－4羥基苯甲醛）。以錦葵素－3－葡萄糖苷（m/z 493）為例，錦葵素－3－葡萄糖苷特征定性離子對應為493/331和493/180.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見圖1（C）所示。

天竺葵素類花青苷的糖苷健斷裂后會檢測到m/z 271的特征離子峰，即為天竺葵素類花青苷苷元;加大碰撞電壓，可得到m/z 120.9的特征碎片離子峰，即為對羥基苯甲醛。以天竺葵素－3－葡萄糖（m/z 433）為例，天竺葵素－3－葡萄糖特征定性離子對應為433/271和433/120.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見圖1（D）所示。

圖1 花青苷質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)裂解圖Fig.1 Mass spectra and proposed fragmentation pathways of anthocyanins

2.2 黑米花青苷類化合物的定性分析

依據(jù)花青苷標準品質(zhì)譜參數(shù)，確定了對應的定性離子對、錐孔電壓和碰撞電壓，通過超高效液相色譜，確定花青苷類物質(zhì)的保留時間。通過定性離子對、錐孔電壓、碰撞電壓和保留時間（允許保留時間偏離±0.05min），對黑米中花青苷類物質(zhì)的組分進行定性分析。

2.2.1 黑米中矢車菊素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過超高效液相色譜柱進行分離，矢車菊素類花青苷標準溶液保留時間如表3所示，對黑米進行檢測可得，黑米中含有矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷和矢車菊素，共5種矢車菊素類花青苷，如圖2所示?？琢瞵幍龋?］采用液質(zhì)聯(lián)用技術與毛細管電泳電化學檢測對黑米色素進行定性分析檢測出矢車菊素－3－葡萄糖苷，孫嫵娟等［12］采用液質(zhì)聯(lián)用技術也檢測出矢車菊素－3－葡萄糖苷;Abdel－Aal等［10］在黑米中檢測出矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷和2個矢車菊素二糖苷（未準確定性）。因此，矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷和矢車菊素這3個矢車菊素類花青苷在黑米花青苷研究中未見報道。

表3 矢車菊素類花青苷標準溶液的保留時間Table 3 Retention time of cyanidins standard

表4 芍藥素類花青苷標準溶液的保留時間Table 4 Retention time of peonidins standard

圖2 黑米中矢車菊素類花青苷總離子色譜圖Fig.2 Total ion current cyanidins of black rice

2.2.2 黑米中芍藥素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過超高效液相色譜柱進行分離，芍藥素類花青苷標準溶液保留時間如表4所示，對黑米進行檢測可得，黑米中含有芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－葡萄糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷和芍藥素，共5種芍藥素類花青苷，如圖3所示。其中芍藥素－3－葡萄糖苷在黑米中已經(jīng)檢測出［7，10，12］，芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷和芍藥素這4種芍藥素類花青苷在黑米花青苷研究中未見報道。

2.2.3 黑米中錦葵素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過超高效液相色譜柱進行分離，如圖4所示，錦葵素－3－半乳糖苷標準溶液保留時間為4.36min，錦葵素類－3－葡萄糖苷保留時間為4.61min，由這2個總離子色譜圖可見黑米中錦葵素類花青苷檢測出錦葵素－3－半乳糖苷和錦葵素類－3－葡萄糖苷。Sam等［13］在黑米中檢測出錦葵素類－3－葡萄糖苷，錦葵素－3－半乳糖苷在黑米花青苷研究中未見報道。

2.2.4 黑米中天竺葵素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過超高效液相色譜柱進行分離，如圖5所示，天竺葵素類－3－葡萄糖苷標準溶液保留時間為3.94min，由總離子色譜圖可見黑米中含有天竺葵素類－3－葡萄糖苷。天竺葵素類－3－葡萄糖苷在黑米花青苷研究中已有報道［13］。

3 結(jié)論

針對黑米中花青苷結(jié)構(gòu)復雜，液相色譜法無法對極性相近化合物進行分離檢測等問題，本研究采用超高效液相色譜－三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，并以多反應監(jiān)測模式，建立了黑米中花青苷類化合物的檢測方法，該方法具有簡便、準確、高效、選擇性強的特點。

圖3 黑米中芍藥素類花青苷總離子色譜圖Fig.3 Total ion current peonidins of black rice

對黑米中花青苷類物質(zhì)進行定性分析，結(jié)果檢測出黑米（黑帥）中的13種花青苷類物質(zhì)分別為矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷、矢車菊素、芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－葡萄糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷、芍藥素、錦葵素－3－半乳糖苷、錦葵素類－3－葡萄糖苷和天竺葵素類－3－葡萄糖苷。其中，矢車菊素類花青苷是黑米中主要花青苷，葡萄糖是黑米花青苷的主要糖配基，本研究首次檢測到黑米中含有矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷、矢車菊素、芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷、芍藥素和錦葵素類－3－半乳糖苷這8種花青苷。

圖4 黑米中錦葵素類花青苷總離子色譜圖Fig.4 Total ion current malvidins of black rice

圖5 黑米中天竺葵素－3－葡萄糖苷總離子色譜圖Fig.5 Total ion current Pg－3－glc of black rice

在此研究基礎上，今后可進一步研究黑米不同品種中花青苷類物質(zhì)的準確定性和定量分析，花青苷類化合物單一組分的分離純化、藥理活性研究和黑米中花青苷類物質(zhì)的代謝途徑等問題。

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