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從粘細(xì)菌中尋找活性物質(zhì)的研究方案

2014-07-25 03:48崔道林陳春麗
關(guān)鍵詞:層析濾紙平板

崔道林 陳春麗

【摘要】本文介紹了尋找生物活性物質(zhì)的必要性和緊迫性,從粘細(xì)菌中尋找生物活性物質(zhì)的優(yōu)點,具體探討了研究粘細(xì)菌活性物質(zhì)的技術(shù)路線。

【關(guān)鍵詞】粘細(xì)菌生物活性物質(zhì)

【中圖分類號】G64 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-3089(2014)03-0033-01

隨著環(huán)境污染的加劇和人類生活方式的變化,心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病、老年性癡呆癥等疾病日益嚴(yán)重地威脅著人類健康,僅病毒病平均每年就新增2-3種。長久以來抗菌素被認(rèn)為是治療傳染性疾病的神奇藥物,然而近年來抗菌藥物正在逐步喪失其神奇療效。隨著抗菌類藥物的廣泛使用,越來越多的病原菌產(chǎn)生了對一種甚至多種抗菌素的耐藥性[1]。人類迫切需要尋找新的、特效的藥物來治療這些疾病。人們都紛紛把目光投向了生物活性物質(zhì),所謂生物活性物質(zhì),是指來自生物體內(nèi)的對生命現(xiàn)象具有影響的微量或少量物質(zhì),主要包括藥用物質(zhì)、生物信息物質(zhì)、毒素等生物體內(nèi)的天然產(chǎn)物。此外,人們還希望利用生物活性物質(zhì)開發(fā)出增進健康、預(yù)防疾病的營養(yǎng)食品、保健食品,有些生物活性物質(zhì)還可用于化妝品中,有的可制成特殊的生物功能材料,使得生物活性活性物質(zhì)成了研究熱點。已經(jīng)被人類開發(fā)的微生物資源如小單孢菌、放線菌和粘細(xì)菌等,在粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)的數(shù)量,僅次于放線菌,真菌和芽孢桿菌,而且從放線菌等微生物中篩選新生物活性物質(zhì)的重復(fù)幾率越來越高,而粘細(xì)菌在這方面具有獨特的優(yōu)勢。就目前情況看,粘細(xì)菌中55%的菌株可產(chǎn)生生物活性物質(zhì),而溶纖維素群粘細(xì)菌甚至高達(dá)95%。這為新結(jié)構(gòu)或新作用機制生物活性物質(zhì)的篩選提供了很好的一類微生物資源。

1.粘細(xì)菌產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的優(yōu)點

從已有的文獻(xiàn)看,粘細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)主要表現(xiàn)以下幾個方面的特點:①種類多。包括芳香族、雜環(huán)類、醌類、大環(huán)類、聚醚類、多烯類、肽類化合物等,這一點與放線菌十分相似。1994 年Schummer 等人還分離到一種含硼生物活性物質(zhì)。②結(jié)構(gòu)新。目前分離到的60 多種基本結(jié)構(gòu)中,僅有3 種是在其他微生物中報道過的。③一株菌可以產(chǎn)生一種基本結(jié)構(gòu)的許多衍生物。例如, Sorangiumcell ulosum Soce 26 可產(chǎn)生50 多種soraphen 的衍生物;Myxococcus fulvus 產(chǎn)生的有35 種不同衍生物。④菌株特異性,而不是種或?qū)偬禺愋?。目前粘?xì)菌分類上已確定的僅有12個屬約40個種,但包含許多菌株。同種的不同菌株產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的差異很大。另一方面,某些生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌的分布可跨越種、屬、甚至科的界限。⑤不同類別的多種生物活性物質(zhì)可由一個菌株同時產(chǎn)生。⑥粘細(xì)菌生物活性物質(zhì)有許多是作用于真核細(xì)胞的,這一點在生物活性物質(zhì)產(chǎn)生菌中是比較特別的。

2.研究粘細(xì)菌活性物質(zhì)的技術(shù)路線

2.1粘細(xì)菌的分離

綜合文獻(xiàn)中的方法,用玻棒平整的一頭印土樣,然后轉(zhuǎn)印在濾紙水瓊脂平板的濾紙上,將接好土樣的平板倒置放于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)。7d左右就可在土樣周圍觀察到粘狀物。將粘狀物轉(zhuǎn)接到濾紙水瓊脂平板的濾紙上培養(yǎng)。3d后,轉(zhuǎn)接到濾紙上的粘狀物有明顯的擴展,變厚。約7~10d后,可觀察到子實體出現(xiàn)。

2.2粘細(xì)菌的液體培養(yǎng)與發(fā)酵產(chǎn)物的提取

從菌種的平板上挑出子實體接種到液體培養(yǎng)基,搖床培養(yǎng)3d作為種子液。以10 %的接種量接種到液體培養(yǎng)基,于30℃,160 rpm 培養(yǎng)2 d ,然后加入2 %(v/v) 高溫滅菌后的SIPI28非極性大孔吸附樹脂,繼續(xù)在搖床中培養(yǎng)5d。

2.3發(fā)酵產(chǎn)物粗提取物的薄層層析分離

粗提物的分離采用硅膠薄層層析。層析板用薄層層析硅膠H(60 型) 制備,采用展層液(石油醚:丙酮=3:1)上行法展層。層析后,在紫外燈下觀察。將點刮下,用甲醇洗脫。10000rpm離心,收集上清,揮發(fā)甲醇,得到分離物。

2.4進行ESL-MS分析

電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)已發(fā)展成為一種通用的質(zhì)譜技術(shù),它是通過測定樣品離子的質(zhì)荷比(m/z)來進行成分和結(jié)構(gòu)分析的方法,ESI-MS從一開始就成為了藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域重要的標(biāo)志性工具,廣泛地使用在組合化合物庫的高通量篩選、雜質(zhì)分析、藥代動力學(xué)研究和代謝產(chǎn)物的確認(rèn),以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的表達(dá)等各方面應(yīng)用領(lǐng)域。

2.5抗菌譜測定

將通過薄層層析得到的分離物,用二甲亞砜溶解,將已滅菌的濾紙片放入浸泡1h ,取出后晾干備用。接著將各種待測菌或孢子懸液分別接種0.5mL 涂布平板,然后將濾紙片分別放在培養(yǎng)基表面,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

粘細(xì)菌中令人感興趣的是其基因組遠(yuǎn)較一般的細(xì)菌基因組大,約9454~10010 kb。大量的基因被“奢侈”地用來合成許多復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物對其自身的意義似乎是長期進化選擇的結(jié)果。豐富次級代謝產(chǎn)物的合成作為粘細(xì)菌生長后期的主要細(xì)胞活動之一,與粘細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生有著密切的關(guān)系。有關(guān)工作的開展不但在資源利用方面具有重要意義,在理解生物進化等生命本質(zhì)問題也有重要意義。

參考文獻(xiàn):

[1]Levy, S.B, Antibiotic resistance-the problem intensifies. Adv Drug Deliv Rev, 2005. 57(10): p. 1446-50.

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