賀 穎，葉志云

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門361102）

鼠雙微體基因X（MdmX，亦稱 Mdm4）是1996年發(fā)現(xiàn)的一個新的p53結(jié)合蛋白［1］，由于它與另一個p53結(jié)合蛋白鼠雙微體基因2（Mdm2）在結(jié)構(gòu)上高度相似，因而被命名為MdmX.它與Mdm2在結(jié)構(gòu)上同源，分別由490和491個氨基酸組成［2］.2個蛋白都具有相似的功能區(qū)：N端p53結(jié)合區(qū)，介導(dǎo)對p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，該區(qū)結(jié)構(gòu)在2種蛋白中嚴(yán)格保守［3］；中央?yún)^(qū)鋅指結(jié)構(gòu)，由第301～329個氨基酸構(gòu)成，其功能均未知［4］；C端RING結(jié)構(gòu)區(qū)，該區(qū)是這2個蛋白形成同源或異源二聚體的關(guān)鍵，也是Mdm2作為泛素連接酶的核心，但MdmX的RING結(jié)構(gòu)域卻不具備泛素連接酶功能［5］.MdmX和Mdm2的蛋白結(jié)構(gòu)主要差異部分在中央酸性區(qū)［4］；另外，Mdm2具有核定位信號（NLS）及出核信號（NES），而MdmX則沒有［2］.在生物學(xué)功能上，MdmX和Mdm2均為p53信號通路中重要的調(diào)控因子，兩者的功能各不相同，無法互相替代.敲除 Mdm2的小鼠胚胎因激活p53依賴的細(xì)胞凋亡通路而死亡，敲除MdmX的小鼠胚胎則因依賴p53的細(xì)胞增殖抑制而死亡，但若同時敲除p53基因，胚胎均能正常發(fā)育［6－9］.Mdm2和 MdmX 在p53信號通路中的調(diào)控關(guān)系非常復(fù)雜，Mdm2可以介導(dǎo)自身及MdmX的泛素化降解［10］，而MdmX與Mdm2的結(jié)合又可穩(wěn)定Mdm2，抑制其降解［11］.兩者在p53通路中的調(diào)節(jié)與它們之間的表達(dá)水平密切相關(guān)，當(dāng)MdmX與Mdm2在細(xì)胞內(nèi)水平相當(dāng)時，它們共同抑制p53的活性；而當(dāng)MdmX表達(dá)量較高時，則可穩(wěn)定p53的表達(dá)［12］.

體軸發(fā)育抑制因子Axin是一個重要的架構(gòu)蛋白，參與Wnt、JNK、TGF－β及p53等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控［13－17］.在p53信號通路中，Axin與p53、HIPK2及Daxx等相互作用形成復(fù)合物，誘導(dǎo)p53的轉(zhuǎn)錄活化，共同促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［18－19］.我們曾報道過 Mdm2在 Axinp53通路中不依賴于其泛素連接酶的抑制功能［20］.Mdm2可通過競爭結(jié)合p53與HIPK2破壞Axin／p53／HIPK2活化復(fù)合體的形成，從而抑制p53的轉(zhuǎn)錄激活及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［20］.然而，MdmX是否參與Axin－p53信號通路的調(diào)控，其作用機(jī)制等仍未知.基于MdmX與Mdm2在結(jié)構(gòu)上的相似性及其在p53信號通路的重要作用，本文對MdmX在Axin－p53信號通路中的作用進(jìn)行了研究.研究表明：與Mdm2相似，MdmX也能通過競爭Axin與p53的結(jié)合，從而抑制Axin對p53的轉(zhuǎn)錄激活.這一發(fā)現(xiàn)有助于全面了解MdmX的細(xì)胞生物學(xué)功能，豐富了Axin－p53信號通路的調(diào)控機(jī)理，并可為腫瘤的臨床治療提供新的線索.

1 材料與方法

1.1 材 料

使用的大部分藥品與試劑分別購自美國Sigma公司、上海生工（Sangon）生物工程公司和華美（Sino－America）生物工程公司；限制性內(nèi)切酶和DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker購自大連寶生（Takara）生物工程公司；堿性磷酸酶（CIP）購自美國Promega公司；Klenow DNA聚合酶、T4DNA 連接酶（T4Ligase）、T4多核苷酸激酶（T4PNK）購自美國Invitrogen公司；用于免疫共沉淀和Western blotting分析的抗HA和DO－1抗體購自美國Santa Cruze公司；抗Axin和GFP的多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室自行免疫新西蘭兔后純化獲得；PVDF膜購自Millipore公司.

1.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

常用的表達(dá)載體如pBluescriptⅡSK及pCMV5等由本實(shí)驗(yàn)室保存；Axin和p53全長表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建參照文獻(xiàn)［14，16］；p53－luc熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建參照文獻(xiàn)［16］；pEGFP－N1質(zhì)粒購自Clontech公司；MdmX全長表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫中編號為NM＿002393的MdmX mRNA 序 列 設(shè) 計(jì) 引 物 （5′－ATG ACA TCA TTT TCC ACC TCT－3′和5′－TTA TGC TAT AAA AAC CTT AAT－3′），以 HEK 293細(xì)胞的總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板進(jìn)行PCR，把MdmX全長PCR產(chǎn)物平端克隆到pBluescriptⅡSK中.測序驗(yàn)證后，用BamH I和XhoI亞克隆到表達(dá)載體pCMV5－HA 中，得到 pCMV5－HA－MdmX；MdmXΔp53則是以pCMV5－HA－MdmX為模板，通過點(diǎn)突變PCR的方法獲得，所用引物序列為：5′－GAC ATC ATT TTC CAC CCT TAG CAC TTT AGC C－3′和 5′－GGC TAA AGT GAC AAG GGT GGA AAA TGA TGT C－3′.

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代

所用的人胚胎腎細(xì)胞HEK 293與293T用含有10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）小牛血清（FBS）、100IU青霉素和100μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2.細(xì)胞傳代時，先將培養(yǎng)液吸去，用PBS緩沖液潤洗一次，再加入適量含0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰酶的0.02%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）EDTA溶液，使其覆蓋細(xì)胞層，待細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落后，加入少量培養(yǎng)液終止胰酶的作用，再用移液管吹打數(shù)次使細(xì)胞彼此分開，加入適量的培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打混勻后便可傳代培養(yǎng).

1.4 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法

轉(zhuǎn)染前24h消化細(xì)胞，離心去除胰酶消化液，加入適量的培養(yǎng)液，重懸浮細(xì)胞并均勻地平鋪在60mm培養(yǎng)皿中，保持細(xì)胞密度約為40%～60%.轉(zhuǎn)染前1h更換細(xì)胞培養(yǎng)液，小心加入約5mL預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)液，以免使貼壁好的細(xì)胞懸浮起來.磷酸鈣－DNA沉淀的制備：在1.5mL離心管中加入220μL水，在水中央位置加入混勻好的DNA質(zhì)粒.將31μL 2mol／L CaCl2小心加入到Eppendorff管底，再沿Eppendorff管壁逐滴加入2×HEPES緩沖液（1.6g NaCl、0.074 g KCl、0.027g Na2HPO4·2H2O、0.2g葡萄糖和1g HEPES依次溶解于90mL雙蒸水中，用0.5mol／L NaOH將pH值調(diào)為7.05左右，加雙蒸水定容至100 mL），在CaCl2與上層溶液形成的界面之間用移液槍吹出幾個氣泡以攪亂其界面，室溫放置20～30min，使磷酸鈣－DNA沉淀緩慢形成.用移液槍吹吸一次混勻后逐滴將磷酸鈣－DNA沉淀加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕微晃動使磷酸鈣－DNA沉淀在細(xì)胞上分布均勻.

1.5 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后24～40h可收獲細(xì)胞.將60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸去，加入500μL裂解緩沖液（20 mmol／L Tris－HCl（pH 7.4），150mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1mmol／L EGTA，1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Triton，2.5mmol／L 焦磷酸鈉，1mmol／Lβ－巰基乙醇，1mmol／L釩酸鈉，1μg／mL亮抑酶肽，1mmol／L蛋白酶抑制劑（PMSF），置于4℃裂解5min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞從盤面刮下，收集在1.5mL Eppendorff管中.隨后在冰上用超聲處理10次，每次1s.超聲處理后的細(xì)胞裂解液在4℃用13 200r／min離心30min.取50μL上清轉(zhuǎn)移到新管，加入等量2×SDS樣品緩沖液作為全細(xì)胞裂解液，置沸水煮10min，后放于－80℃?zhèn)溆?剩余上清用于免疫共沉淀分析.取5 μL蛋白A／G瓊脂糖珠（Santa Cruz Biotech公司），用適量裂解緩沖液洗3次，每次3 000r／min離心3 min；洗完后，取5μL相應(yīng)抗體與瓊脂糖珠及400μL細(xì)胞裂解液上清和400μL裂解緩沖液混合，在4℃層析柜中緩慢顛倒混合3h，使蛋白從細(xì)胞裂解液中被特異性抗體免疫沉淀下來.免疫沉淀反應(yīng)完成后，在4℃以3 000r／min速度離心3min，小心吸去上清，用500μL裂解緩沖液溫和清洗瓊脂糖珠3次，最后用30 μL裂解緩沖液重懸瓊脂糖珠，再加入等量的2×SDS樣品緩沖液，沸水煮10min，存于－80℃?zhèn)溆?

1.6 熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

鋪適當(dāng)密度的細(xì)胞于6孔或12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長到培養(yǎng)板孔面積的90%后，轉(zhuǎn)染0.5μg熒光素酶報告基因、適量的質(zhì)粒DNA，以及0.2μg pEGFP－N1.轉(zhuǎn)染24h后，吸凈培養(yǎng)液，向每孔加入200μL 細(xì)胞裂解液（0.05mol／L Tris（pH 7.8），1 mmol／L DTT，0.1% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Triton－X100），使其覆蓋細(xì)胞層，放入4℃充分裂解細(xì)胞10min.取50μL細(xì)胞懸液，與100μL熒光素／ATP混合溶液（ATP溶液：0.125mol／L Tris，25mmol／L MgCl2，2.4mg／mL ATP；熒 光 素 溶 液：0.278mg／mL 熒 光 素，5 mmol／L KH2PO4（pH 7.8））于渦旋混勻器快速混勻后，在熒光檢測儀（Promega公司）讀取發(fā)光值并記錄.同時取剩余20μL裂解液上清，通過 Western blotting分析檢測綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)量作為內(nèi)標(biāo)，以矯正系統(tǒng)讀數(shù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果為至少5次實(shí)驗(yàn)的平均值.

2 結(jié) 果

2.1 MdmX能抑制Axin誘導(dǎo)的p53的轉(zhuǎn)錄激活

首先，運(yùn)用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測MdmX對Axin激活p53轉(zhuǎn)錄活性的影響.在HEK 293細(xì)胞中轉(zhuǎn)入0.5μg的p53－luc報告基因，然后以圖1中的各種組合分別轉(zhuǎn)染2μg Axin，3μg HA－MdmX 或?qū)xin和MdmX共轉(zhuǎn)染，用空載體補(bǔ)平各孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入的DNA量，保證各蛋白表達(dá)水平基本一致，并且在每組細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染0.2μg的GFP作為內(nèi)標(biāo).圖1中的Western blotting結(jié)果為細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)情況.可以看到，單轉(zhuǎn)Axin時（第二道），熒光素酶活性增強(qiáng)了9倍左右，說明Axin強(qiáng)烈誘導(dǎo)p53的轉(zhuǎn)錄活性.而當(dāng)MdmX與Axin共轉(zhuǎn)染時（第四道），熒光素酶的活性明顯下降，說明MdmX能抑制Axin對p53的激活.

2.2 MdmX與p53的結(jié)合域是其抑制Axin激活p53的關(guān)鍵

MdmX是如何抑制Axin對p53的激活成為我們研究的下一個重點(diǎn).之前的研究發(fā)現(xiàn)Mdm2是通過與p53的結(jié)合抑制Axin對p53的激活［20］，而MdmX具有與Mdm2相似的p53結(jié)合域，為了驗(yàn)證MdmX是否也能通過它與p53的結(jié)合對Axin激活p53產(chǎn)生影響，構(gòu)建了MdmX缺失p53結(jié)合域的突變體MdmXΔp53.在HEK 293細(xì)胞中以圖2中各組合方式轉(zhuǎn)染2μg Axin，3μg MdmX及3μg MdmXΔp53，同時共轉(zhuǎn)染0.5μg p53－luc熒光素酶報告基因和0.2 μg的GFP，用空載體補(bǔ)平各組細(xì)胞轉(zhuǎn)入的DNA量，保證各蛋白表達(dá)水平基本一致.圖2中的 Western blotting結(jié)果表示細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)情況.可以看到，MdmXΔp53不能抑制Axin對p53的激活，說明MdmX可能通過與p53的結(jié)合抑制Axin對p53的轉(zhuǎn)錄激活.

圖1 MdmX對Axin激活p53的影響Fig.1 Effect of MdmX on Axin－induced p53transcriptional activation

圖2 MdmXΔp53對Axin激活p53的影響Fig.2 Effect of MdmXΔp53on Axin－induced p53transcriptional activation

2.3 MdmX競爭Axin與p53的結(jié)合

為了檢測MdmX能否與Axin競爭結(jié)合p53，從而導(dǎo)致對Axin－p53信號通路的抑制，在HEK 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2μg Axin，再共轉(zhuǎn)入DNA濃度依次遞增（0，2，4，8μg）的 HA－MdmX.轉(zhuǎn)染24h后收集并裂解細(xì)胞，用耦聯(lián)p53多克隆抗體的瓊脂糖珠免疫沉淀細(xì)胞中內(nèi)源的p53.Western blotting檢測免疫沉淀物和全細(xì)胞裂解液，用抗p53的單克隆抗體DO－1、抗Axin和抗HA的抗體分別檢測p53、Axin和MdmX的表達(dá)情況.如圖3所示，隨著MdmX表達(dá)量的增加，與p53共沉淀的Axin逐漸減少，說明MdmX可以減弱Axin與p53的相互作用.

圖3 MdmX對Axin與p53相互作用的影響Fig.3 Effect of MdmX on the interaction between Axin and p53

通過上述熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)，可以得知MdmX的p53結(jié)合域是其抑制Axin激活p53的關(guān)鍵，可以推測缺失p53結(jié)合域的MdmX是無法與Axin競爭p53結(jié)合的.在HEK 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2 μg Axin，然后共轉(zhuǎn)染不同濃度梯度（3和8μg）的HAMdmX或HA MdmXΔp53.轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，用耦聯(lián)p53多克隆抗體的瓊脂糖珠免疫沉淀內(nèi)源p53，觀察共沉淀的MdmX及其突變體的變化.如圖4所示，MdmXΔp53由于不能與p53結(jié)合，不影響Axin與p53的相互作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了MdmX能通過與p53的結(jié)合抑制Axin與p53的相互作用.

圖4 MdmXΔp53對Axin與p53相互作用的影響Fig.4 Effect of MdmXΔp53on the interaction between Axin and p53

3 討 論

MdmX與Mdm2均為p53信號通路中重要的負(fù)調(diào)控因子.Mdm2的主要功能為介導(dǎo)p53的泛素化降解，從而影響p53的穩(wěn)定性，而MdmX則主要抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性［12］.本實(shí)驗(yàn)室前期的研究證明Axin／p53活化復(fù)合體在p53的轉(zhuǎn)錄激活及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用［20］.本文的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) MdmX對Axin－p53信號通路的抑制與 Mdm2相似，都是通過競爭Axin與p53的結(jié)合而實(shí)現(xiàn).這有別于以往認(rèn)為的兩者在作用機(jī)制上完全不同，提示結(jié)構(gòu)上的相似性在某些基因調(diào)控方面還是起到類似的功能.但兩者在Axin／p53活化復(fù)合體中的功能是否可以相互替代，或者兩者需要協(xié)同進(jìn)行作用應(yīng)是下一步研究的重點(diǎn).另外，MdmX能否與Axin／p53復(fù)合體中其他成員如HIPK2等發(fā)生相互作用而影響p53信號通路的調(diào)節(jié)，在各種DNA損傷刺激下其表達(dá)水平的變化對Axin／p53活化復(fù)合體有何影響等問題也很值得繼續(xù)進(jìn)行深入的研究.此外，MdmX在Axin－p53信號通路中的抑制作用也為某些腫瘤的臨床治療提供了新的線索.在很多有野生型p53表達(dá)的腫瘤中，如乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤及惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，發(fā)現(xiàn)有MdmX基因的擴(kuò)增［8］，在這些腫瘤細(xì)胞中Axin／p53活化復(fù)合體的功能會由于大量MdmX的競爭作用而被抑制.已有研究證明，在一定劑量的抗腫瘤藥物阿霉素（doxorubicin）作用下，Axin／p53活化復(fù)合體會被誘導(dǎo)大量生成，引起細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的形成［20］.但是其有效作用劑量較大，對正常細(xì)胞的損傷也很嚴(yán)重，具有很強(qiáng)的毒副作用.如果能加入MdmX與p53結(jié)合的阻斷劑，使這些MdmX過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中Axin／p53活化復(fù)合體的作用不被 MdmX所抑制，就有望降低阿霉素的用量，減少治療時對正常細(xì)胞的毒副作用，達(dá)到更好的腫瘤治療效果.

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