（麗水學(xué)院成教學(xué)院，浙江麗水 323000）

多糖廣泛存在于植物、動物和微生物組織中，它具有合成高分子所沒有的特殊生物活性，是生命有機體的重要組成部分，并且具有多種多樣的生物學(xué)功能[1]。猴頭菇是一種珍貴的食用兼藥用菌，富含多種營養(yǎng)成分[2]。醫(yī)學(xué)研究表明：猴頭菇性平，味甘，有利五臟，助消化，滋補身體等功效，特別是對胃潰瘍，十二指腸潰瘍和神經(jīng)衰弱等患者有很好的保健效果[3]。

鑒于上述猴頭菇多糖的諸多優(yōu)點，其廣闊的開發(fā)利用價值不言而喻。關(guān)于猴頭菇多糖的提取方法的報道不斷出現(xiàn)。常用的有熱水浸提法、稀堿液浸提法、稀酸液浸提法等[4-6]。水提取法溶劑用量大、耗時且效率低，酸堿提取法又易導(dǎo)致多糖立體結(jié)構(gòu)的破壞及生物活性的改變。近年研究較多的新型提取法有超聲波輔助法[7]和酶輔助法[8]，這兩種方法比傳統(tǒng)的提取方法省時、節(jié)約溶劑、提取效率高。但由于超聲波法對儀器的要求較高較難推廣應(yīng)用，而生物酶價格昂貴阻礙了酶法提取的廣泛應(yīng)用。微波輔助熱水浸提是一種頗具發(fā)展前景的新型提取技術(shù)，微波作為一種電磁能可以大大節(jié)約提取時間，提高提取速度[9]。本文研究采用微波輔助法提取猴頭菇多糖。

在優(yōu)化提取工藝過程中，常需同時考察多個因素對結(jié)果的影響，并對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用固定其他因素而改變某一因素（One Factor at A Time，OFAT）的單因素考察法能收到一定效果，但條件優(yōu)選憑經(jīng)驗，且無法考察各因素間的相互作用。當(dāng)因素水平數(shù)較少時可采用析因設(shè)計（Factorial Design）；較多時，需采用實驗次數(shù)較少的實驗設(shè)計優(yōu)化法。國內(nèi)常用均勻設(shè)計和正交設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化，但這兩種方法實驗精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較差。而近年來國內(nèi)外許多藥學(xué)工作者采用Box-Behnken效應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[10-12]，它適用于多因素多水平試驗設(shè)計，使用方便，優(yōu)選條件預(yù)測性好。因此，本文利用Box-Behnken效應(yīng)面法對微波提取猴頭菇多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，并得到最佳工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

MM721AAU-PW：佛山寺順德區(qū)美的微波電器制造公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；DL-6000B離心機：湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；FD-8冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；UV-3紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 材料與試劑

猴頭菇細(xì)粉100目：購自浙江省方格藥業(yè)有限公司；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；苯酚、硫酸、乙醇、乙酸鉛（均為分析純）。

1.3 方法

1.3.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照文獻(xiàn)[13] 采用苯酚-硫酸法測定猴頭菇中多糖含量。精確稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg至250mL容量瓶中，加適量水溶解，加水至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 至 9 支試管中，依次加水，使最終體積均為2 mL，另取2 mL蒸餾水作空白試驗。用移液管向每支試管各加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻。再向每支試管中緩慢加入濃硫酸5 mL，充分渦旋，冷卻至室溫。在490nm下測定吸光度，以葡萄糖的濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：C=6.317 4A-0.003 1，R=0.999 6，表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.005 mg/mL～0.045 mg/mL內(nèi)濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 猴頭菇多糖提取工藝

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

取2.0 g猴頭菇細(xì)粉，按一定的料液比加入蒸餾水，于微波爐中提取一定時間，取出置于100℃水浴中加熱30 min，離心取上清液，真空濃縮后按1∶4的比例加入95%乙醇，醇沉過夜，離心收集沉淀，加蒸餾水復(fù)溶，采用Sevag法與乙酸鉛相結(jié)合去除蛋白質(zhì)，用無水乙醇反復(fù)沖洗多次后，冷凍干燥，既得猴頭菇多糖。

將制備的猴頭菇多糖用蒸餾水溶解，定容于500mL容量瓶中，按照“1.3.1”項下處理，并在490 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算猴頭菇多糖提取率。

多糖提取率（%）=[多糖含量（g）/原料重量（g）] ×100

1.3.3 單因素試驗

影響微波提取多糖得率的主要因素為料液比、微波功率、微波處理時間。本文對料液比選取1∶20，1∶30，1 ∶40，1 ∶50，1 ∶60，1 ∶70（g/mL）6 個水平；微波功率選取 119、231、385、539、700 W 5 個水平；微波處理時間選取 2、4、6、8、10、12、14 min 7 個水平，分別進(jìn)行單因素試驗。

1.3.4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖的提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對猴頭菇多糖的提取工藝影響較顯著的3個因素：料液比（X1，g/mL）、微波功率（X2，W）和微波處理時間（X3，min）為考察對象，以提取率（Y，%）為評價指標(biāo)，利用3因素3水平的Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖的提取工藝，并且按最佳提取條件進(jìn)行驗證試驗。因素水平見表1，制備工藝優(yōu)化試驗安排及結(jié)果見表2。

表1 實驗設(shè)計水平表Table 1 Variables in the Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 微波提取猴頭菇多糖的單因素試驗

2.1.1 料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

在微波功率為385 W、提取時間為10 min的條件下，分別按料液比為 1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1 ∶70（g/mL）的比例提取猴頭菇多糖，計算猴頭菇多糖提取率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對猴頭菇多糖提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖2可知，猴頭菇多糖提取率隨著溶劑量增大而增大，料液比在 1 ∶40～1 ∶50（g/mL）之間提取率顯著提高，繼續(xù)提高料液比提取率略有下降，因此選擇料液比為 1 ∶50（g/mL）。

2.1.2 微波功率對多糖提取率的影響

在料液比 1∶50（g/mL）、提取時間 10 min的條件下，分別用 119、231、385、539、700 W 的微波功率進(jìn)行微波提取，計算猴頭菇多糖提取率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 微波功率對猴頭菇多糖提取率的影響Fig.3 Effects of microwave power on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖3可知，隨著微波功率的增大提取率增大，當(dāng)微波功率到385 W時提取率到最高值，微波功率繼續(xù)增大提取率降低。研究[14-15]表明，微波功率越大，單位時間內(nèi)微波輻射能量越高，體系溫度升高越快，從而使固定物料在單位時間內(nèi)獲得的生物能量逐步增加，加劇物料細(xì)胞的破裂和組織中多糖類物質(zhì)分子及溶劑分子的熱運動，因而使多糖提取率增加。而功率過大易使多糖降解，使提取率降低。而且微波功率過大會發(fā)生爆沸也影響提取率，因此最后確定微波功率為385 W。

2.1.3 微波提取時間對提取率的影響

在料液比1∶50（g/mL）、提取功率385 W的條件下，分別將物料用 2、4、6、8、10、12、14 min 進(jìn)行微波提取，計算猴頭菇多糖提取率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 微波處理提取時間對猴頭菇多糖提取率的影響Fig.4 Effects of microwave time on extraction rate of Hericium Erinaceus Polysaccharide

由圖4可知，微波處理時間加長提取率升高，在10 min時提取率明顯提高，而10 min后提取率又明顯下降，可能是因為微波處理時間過長易使多糖水解，致使提取率下降，因此微波輔助最適時間為10 min。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理及模型擬合

采用“Design Expert 7.0”實驗設(shè)計軟件，對猴頭菇多糖微波提取工藝所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以評價指標(biāo)（因變量）分別對各因素（自變量）進(jìn)行多元線性回歸和二項式方程擬合。對二項式方程中的各項系數(shù)進(jìn)行F檢驗，所得結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計表與效應(yīng)值Table2 Box-Behnken experiment design independent（X）and dependent variables（Y）

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Significance test of coefficient in regression equation

獲得猴頭菇多糖提取率對編碼自變量的二次多項回歸方程：

Y=14.03+0.49X1+0.50X2+0.067X3-0.86X1X2-0.19X1X3-0.59X2X3-1.01X12-0.68X22-1.13X32（Pr=0.0420）

由擬合方程的相關(guān)系數(shù)（Pr=0.042 0）可知模型擬合程度良好，可以用此模型對猴頭菇多糖微波提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。從表3回歸系數(shù)的顯著性檢驗可知，方程模型中X1（Pr=0.071 5）、X2（Pr=0.067 5）、X1X2（Pr=0.037 0）、X12（Pr=0.024 1）、X22（Pr=0.085 4）、X22（Pr=0.016 4）項極顯著，說明料液比、微波功率及其這兩個因素之間的交互作用對多糖提取率影響較為顯著。

由圖5（A）可知，猴頭菇多糖提取率隨著料液比（X1）的增加而增大，隨著微波功率（X2）的增加先增加后降低；由圖5（B）可知，猴頭菇多糖提取率隨著料液比（X1）的增加出現(xiàn)先增加后降低趨勢，隨著微波處理時間（X3）的增加也出現(xiàn)先增加后降低趨勢；由圖5（C）可知，猴頭菇多糖提取率隨著微波功率（X2）的增加呈增加趨勢，隨著微波處理時間（X3）的增加也出現(xiàn)先增加后降低趨勢。

圖5 效應(yīng)面曲面圖Fig.5 Response surface plot

2.1.5 優(yōu)化工藝參數(shù)驗證

以猴頭菇多糖提取率為指標(biāo)，根據(jù)“Design Expert 7.0”實驗設(shè)計軟件得最佳猴頭菇多糖微波提取工藝參數(shù)為：料液比 1 ∶50.5（g/mL），微波功率 405 W，微波處理時間9.5 min。按照“2.1”項下以優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取3批猴頭菇多糖，并按照“1.3.1”項下測定猴頭菇多糖含量，平均提取率為（13.92±0.13）%（n=3），實驗觀測值與模型預(yù)測值偏差為3.75%，可知，實驗觀察值和模型預(yù)測值比較接近，說明模型預(yù)測性良好。

3 結(jié)論

Box-Behnken效應(yīng)面法是多因素3水平的實驗設(shè)計，是在2水平析因設(shè)計的基礎(chǔ)上加上極值點和中心點構(gòu)成的，可在試驗中進(jìn)行非線性擬合，具有操作簡單、試驗次數(shù)少、精度高、預(yù)測性好等優(yōu)點。因此，Box-Behnken效應(yīng)面法在提取工藝領(lǐng)域具有較好的推廣應(yīng)用價值。需要注意的是Box-Behnken效應(yīng)面法因素一般為2～5個，因素不能太多，否則試驗次數(shù)無法接受，一般不宜采用。

本實驗利用微波提取法對猴頭菇多糖提取工藝進(jìn)行研究，實驗結(jié)果經(jīng)Box-Behnken效應(yīng)面法分析與優(yōu)化，模型擬合程度良好，確定的最佳提取工藝條件分別為：料液比 1 ∶50.5（g/mL），微波功率 405 W，微波處理時間 9.5 min，平均提取率為（13.92±0.13）%（n=3），實驗觀測值與模型預(yù)測值偏差為3.75%，由此可知，Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確，具有實際可操作性。

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